IL―17体外促进小鼠脾淋巴细胞对髓母细胞瘤的生长抑制作用.docVIP

IL―17体外促进小鼠脾淋巴细胞对髓母细胞瘤的生长抑制作用 　　[摘要]目的研究在脾细胞抗髓母细胞瘤的免疫过程中，IL-17所起的免疫调节功能。方法将小鼠脾脏取得的脾淋巴细胞在不同浓度的IL-17下与髓母细胞瘤Daoy细胞株共培养，以Daoy细胞株单独培养组作为对照，用二苯基溴化四氮唑蓝法测定细胞毒性效应。结果实验结果发现各组Daoy细胞株和脾细胞共培养组在不同浓度IL-17（20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL）条件下细胞抑制率有统计学意义（P0.01），且IL-17在一定浓度范围内（20～80ng/mL），IL-17浓度越高，髓母细胞瘤的细胞生长抑制率越大。此外且随着时间的增加，各组肿瘤细胞的生长抑制率也均有增加。结论IL-17在一定浓度范围内能增加小鼠脾细胞对髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制作用，且在一定时间段内，随着时间的增加，各组肿瘤细胞的生长抑制率也均有增加。 　　[关键词]髓母细胞瘤；IL-17；Th17细胞；MTT法；细胞生长抑制率 　　[中图分类号]R739.41 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-30-04 　　髓母细胞瘤是儿童最常见的原发性恶性肿瘤之一，恶性程度高，不但手术后容易复发，还可沿蛛网膜下腔转移到脑脊髓和脑室各处，治疗困难，在恶性肿瘤的治疗新方法的探索中，目前肿瘤的免疫治疗也越来越被重视，本研究探讨在脾细胞抗髓母细胞瘤的免疫中，IL-17所起的免疫调节功能。 　　1材料与方法 　　1.1一般材料 　　细胞株：髓母细胞瘤Daoy细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所；采用含10%胎牛血清FBS（上海启凡生物科技有限公司，货号：1099141）、105U/L青霉素、100mg/L链霉素（上海启凡生物科技有限公司，货号的MEM培养液（GIBCO公司，货号：11095-072），置于37℃、5%CO2培养箱（Thermo公司，型号：3111）内培养进行培养，取对数生长期细胞进行试验。 　　1.2小鼠脾淋巴细胞制备 　　Balb/c雄性小鼠由复旦大学医学院神经生物国家重点实验室提供，取12只6周龄的小鼠，通过脱颈椎处死，在无菌条件下手术取脾，用Hanks液洗涤1次后，置于200目金属网上进行研压碾磨过滤，收集网下脾细胞悬液。滤过的脾细胞以1000r/min离心5min，弃上清液，加红细胞裂解液溶解红细胞，反复洗涤后，重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（GIBCO公司，货号：31800-022），调整细胞浓度为1×107/mL。加入ConA至3mg/mL，置于37℃，5%CO：培养箱中培养。 　　1.3 MTT法进行体外细胞杀伤活性实验 　　实验组以1×105/mL髓母细胞瘤Daoy细胞株为靶细胞，1×106/mL小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞，混合后接种到96孔板，每组4个复孔，除对照组外，各组共培养液加入不同浓度的IL-17（ProSpec公司，货号：CYT-640）；以未加入脾淋巴细胞的单纯髓母细胞瘤Daoy细胞株为对照组。各组均置于37℃，5%CO2孵箱内共培养，分别在24h、48h、72h后，加入5mg/mL的MTT溶液（Duchefa公司，货号：P215600）20μL，37℃继续培养4h后弃上清终止培养；每孔加入DMSO 200μL，37℃振荡10min，在酶标仪（Thermo公司，型号：Multiskan FC）490am处测各孔光吸收度（OD），计算各组细胞的杀伤率。杀伤率=[（对照组平均0D490值一实验组平均OD490值）/对照组平均OD490值]×100%。结果见表1。 　　1.4统计学处理 　　采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析及S-N-K法检验。所有的变量均以（x±s）表示，以P0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1 IL-17可增加脾淋巴细胞对髓母细胞瘤Daoy细胞株的生长抑制作用 　　髓母细胞瘤Daoy细胞株和小鼠脾淋巴细胞进行共培养，用MTT法测定未加入IL-17和加入不同浓度的IL-17的各组的体外细胞杀伤活性。实验分别对24h、48h和72h各组生长抑制率用SPSS16.0软件进行单因素反差分析，结果见表1和图1：显示不同浓度IL-17组的细胞抑制率有显著统计学差异（24h，F=1327，P0.01；48h，F=2198，P0.01：72h，F=1290，P0.01）。进一步进行S-N-K法检验，发现Daoy细胞株+脾细胞+不同浓度IL-17（20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL）各组的细胞抑制率有统计学差异（注：S-N-K法检验SPSS16.0软件仅在无统计学意义组显示P值）。且IL-17在2