酿造工业用曲霉菌的RAPD分析.pdf

发酵工程学科的进展 ——第四次奎国发酵工程学术甘静套静文集 酿造工业用曲霉菌的RAPD分析 王斌，潘力’， 郭 勇 (华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510640) RAPD分子标记技术对16株酿造工业用曲毒菌进行了系统发育分析。通过改进提取方法， 获得了质量较好的基因组DNAf从9个特选引物中筛选倒3十扩增产物谱带多、特征好、覆 的稳定性，扩增产物谱带一般8～“条，各试验菌株主带4～9条，次带丰富。由此构建的幕 统进化树较好地吻台了传统的形恋分类学，证实了RAPD分子标记技术在此共微生物幕统 发育分析中应用的可行性，也为酿造工业中挂出产黄曲霉毒素的污染菌株提供了理论基础． 关键词：曲年苗；RAPDf系统发育分析}黄曲霉毒素 酿造工业用曲霉菌主要是黄曲霉菌群(Aspergillus．∥。”ⅡsGroup)中的一些丝状真 菌，包括米曲霉、黄曲霉、酱油曲霉等。米血霉具有较强的蛋白质分解能力，同时也具有 糖化活性，很早就被用于酱油和酱类生产上}黄曲霉产生的液化型淀粉酶较黑曲霉强，蛋 白质分解能力仅次于米曲霉，并且它还能分解DNA产生核苷酸；酱油曲霉则主要应用于 酱油酿造行业。鉴于这类丝状真菌在酿造工业上的重要应用，对其进行分类研究就显得 十分重要。另一方面，工业生产中时常污染一些产黄曲霉毒素的菌株(多为黄曲霉)，严 重危害酿造行业的生产安全性。因此加强酿造工业用曲霉菌的分类研究，对产毒菌株加 以区别、鉴定，是十分必要的。RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)分子标记， 技术o]，现已广泛应用于动植物及微生物的遗传变异、分子进化、杂交育种和基因组研究 等领域o-1，但其在酿造工业用曲霉菌分类研究中的应用还不多见。本文应用RAPD分 子标记技术对1G株酿造工业用曲霉菌进行分类分析，考察RAPD分子标记技术在此类 真菌分类中应用的可行性，为其在真菌分类中的应用积累经验。 1 材料与方法 1．1试验菌株殛其来源 16株试验菌株包括米曲霉5株、黄曲霉6株、酱油曲霉5株，购自中国普通微生物菌 通讯作者：潘力，博士，副教授．主要从事工业微生物、医药微生物及生物化工方面的研究，Tel：020 E--malh btlipan@SCUt．edu．cn 158 第四次全国发酵工程学术讨论会 带I的菌株可产生黄曲霉毒素． 1．2仪器与试剂 Biofuge gradient梯度 PCR仪；德国CHRIST 美国Pall公司PURELABPLUS型纯水仪等。 14I PCR试剂盒、RNase、DNA分子量标准(X-EeoT 常规试剂为国产分析纯试剂。 1．3形态特征观察试验 将16株试验菌株从活化的斜面培养物中穿刺接种到查氏培养基平板上，置28℃培养 箱中培养，每天观察菌株生长状态，待培养特征明显时(五天左右)拍照并采集特征数据。 1．4基因组DNA的提取和RAPD扩增反应 将试验菌株的孢子悬浮液接种于综合马铃薯液体培养基中，28℃，200r／min振荡培 养两天左右。过滤收集菌丝体，冻干，液氮研磨后转移至EP管中，参考LauraE．via等c5] 人的方法经改良后提取基因组DNA，双蒸水(加人适量10 RNase)溶解后置--20 mg／mL ℃保存备用。1％琼脂糖凝肢电泳和分光光度法检测DNA的质量和浓度。 RAPD扩增反应由Mastercyclergradient梯度PCR仪完成，所使用的9个引物列于 buffer 2．5 表2，由美国Invitro