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酶的活性部位工程 张今李爽姜大志盛永杰 吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，130021 电话：0431-8498985，传真：0431-8980440 E—mini：zhangjin@mailOlu．edu．cn 目前工程酶的研发已由过去主要靠现有蛋白质骨架的修饰转向酶的活性中心 的改进，并创建了几种方法，例如“活性中心模板”法，“活性中心嫁接”法，“活 性中心进化”法，“活性中心模拟”法等。近年来，我们通过酶活性部位的进化、 酶活性部位的进化构建、酶活性部位的设计对酶分子进行改造。 一、蛋白质酶的活性部位工程 1、三．天冬氨酸酶活性部位的进化 L．天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶(它主要用于由富马酸和氨来生产L．天 冬氨酸)，我们用定向进化技术对L．天冬氨酸酶的活性部位进化，“进化酶”(evolved enzyme)活力提高28倍，pH稳定性和热稳定性都有所提高。 在此基础上，我们将经过活性部位进化的L．天冬氨酸酶与0【．天冬氨酰二肽酶 的进化酶构建杂合酶，获得的杂合酶具有87％的L．天冬氨酸酶活性和309％的a． 天冬氨酰二肽酶活性。结果表明，在进化酶基础上构建杂合酶可能是一种有效的 途径。 2、三．天冬氨酸酶活性部位的进化构建 E．coliW的L．天冬氨酸酶是由四个相同亚基组成，并呈点对称P212㈨2排列， 单亚基无催化功能，每个亚基由三个结构域组成(D1，D2和D3)呈S形。中央 结构域(D2)含有一半以上的氨基酸残基，它是天冬氨酸酶．富马酸酶族最保守的 结构域。D2的核心是由五个长螺旋构成，其轻微弯曲并近于彼此平行，它对于保 持活性构象至关重要。由于亚基间相互作用，来自四个亚基的D2五个螺旋束形成 一个稳定的20螺旋簇，从而构成四聚体。我们分别钓取L一天冬氨酸酶D1D2和 D2D3结构域片段，在两个结构域片段之间加上一段随机六肽突环，通过筛选获得 了一株高活力突变体drAsp017，分子量8lkD，表明它是一种单体酶，相对活性是 活力残留仅为17％，对盐酸胍的稳定性高于天然酶，催化反应的M92+半饱和浓度 和L．天冬氨酸半饱和浓度数据显示突变体drAsp017与天然酶之间存在明显的差 异。实验结果表明，通过活性部位的进化构建来改造寡聚酶，以获得它们的功能 单体和研究酶的结构与功能以及酶的进化提供了一个研究模型。 3、人溶菌酶“多活性中心”设计 我们以人溶菌酶为模型，通过体外外显子顺式，反式重复获得“多中心”酶， 初步研究表明，两种“多中心”酶的稳定性与天然酶基本接近，而通过外显子顺 式重复获得的“多中心”酶活性提高约20倍，反式重复获得的“多中心”酶活性 提高约17倍。该研究不仅可以为工程酶提供新的理论、策略和方法，而且也可提 供经济实用的工程酶，这可能具有普遍的指导意义。 二、核酸酶的活性部位工程 1、环状核酶活性部位的设计 9 根据酶活性部位柔性的基本理论，考虑RNA柔性比DNA大，我们设计了一 个环状RNA．DNA酶。我们考虑核酶缺乏多种催化基团，各种二级结构相互作用 (特别是疏水核心)和调节结构域，设计一个以锤头核酶为活性中心，以DNA为 之锤头核酶，它有较高的活性和稳定性以及对二价金属离子的亲合力。通过引入 调节结构域以调节刚性(对稳定性而言)和柔性(对活性而言)之间的最佳平衡， 提高环状RNA．DNA酶对环境的适应性。这是一种新型结构的核酶。 2、环状脱氧核酶活性部位的设计 脱氧核酶是DNA，所以无法象核酶和反义RNA那样借助于一般载体实现体 内复制。为了实现脱氧核酶的体内复制，我们针对青霉素耐药TEM族系D．内酰胺 酶mRNA设计了一个环状结构脱氧核酶。它是将定向进化获得的“10．23”结构脱氧 核酶的基因克隆到M13mpl8单链DNA载体中构建而成。该酶在体外有较高的酶 活力。在体内，环状脱氧核酶导入D．内酰胺酶产酶菌后，借助M13mpl8单链载 体系统成功的实现体内复制，并表现出了较高的酶活力。这种环状结构脱氧核酶 是一种新型结构的脱氧核酶，它不仅为脱氧核酶的体内复制提供了一条新途径， 而且拓宽了脱氧核酶发展的空间。 10