酶法测定美白剂美白功效实验体系的优化.pdf

酶法测定美白剂美白功效实验体系的优化 任清 贺敏 赵华董银卯4 北京工商大学北京市植物资源研究开发重点实验室 摘要：本文对美白剂抑制酪氨酸酶活性实验体系进行了优化，确定了实验体系的最佳底物浓度和反应时 间，并对美白剂浓度与其对酪氨酸酶抑制率的关系进行了研究。 美白剂是化妆品最重要的功效成分之一，主要是通过作用于皮肤黑色素形成途径的某个环节，控制、 抑制黑色素的生成。酪氨酸酶是黑色素形成最关键的限速酶，国内外大多数化妆品中的美白剂是通过抑 制酪氨酸酶活性，以减少黑色素的生成而达到美白的效果。因此，在化妆品的功效评价中，常常以美白 剂对酪氨酸酶活性的抑制率作为评价美白剂美白功效的重要指标。 近年来，国内外都开展了酶法测定美白剂对酪氨酸酶活性的抑制实验【l培j，但这些测定方法的实验 体系不统一，同一种美白剂，在不同的的实验中可能会得出不同的结果。因此，优化酶法测定美白剂美 白功效实验体系，建立统一的标准是非常必要的。本实验对影响实验结果的底物浓度和反应时间进行了 较为深入的研究，为建立化妆品美白功效评价标准提供理论依据 1材料和方法 1．1实验材料和主要仪器 2300紫外分光光度记；分析天平， L一酪氨酸；酪氨酸酶(Sigma)；pH6．8磷酸缓冲液； 供试的美白剂有熊果苷(原料公司赠送)、燕麦提取物I(本实验室提供，可溶性固形物含量为7．4％ 的液体)和燕麦提取物II(本实验室提供，另一种提取工艺获得，可溶性固形物含量为6．5％的液体) 1．2实验方法 实验一：照表1数据，先加入L一酪氨酸和磷酸缓冲液，混匀，37℃水浴保温10分钟，然后加入酪 氨酸酶液，分别在反应2分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟、12分钟和15分钟，以B作为参比 溶液测定Al、A2、A3、～、A5、 A6、A7和A8在475nm处的吸光值。每组平行实验三次，表中磷 酸缓冲液pH值为6．8，酪氨酸酶液浓度为100U／ml，L一酪氨酸浓度为0．05％． 表1实验一反应液组成 试剂 Al A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 B 酪氨酸 1 1 l 1 1 1 1 1 1 酪氨酸酶液 0．05 0．1 O．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0 磷酸缓冲液 1．95 1．9 1．8 1．7 1．6 1．5 1．4 1．3 2 合计 3 3 3 3 3 3 3 3 3 制剂的反应体系，分别测熊果营、燕麦提取物I和燕麦提取物II三种抑制剂的Tl值，T2为相应的Tl 的参比液。每组平行实验3次，计算平均值，利用下列公式计算样品对酪氨酸酶的抑制率 酪氨酸酶的抑制率：—9二LX100％ C1 370 表2实验二反应液组成 2．结果与讨论 2．1最适酶用量和反应时间的确定 在该酶促反应过程中，生成的产物与酶用量和反应时间的关系如图1和表3，当底物浓度一定时，随 着时间的延长，反应体系在475nm处的吸光值越来越大，即生成的多巴醌越来越多，然而，当反应体系的 吸光值达到一定的值时，即使延长反应时间，吸光值也不再增加，即吸光值达到最大值。酪氨酸酶浓度 不同，吸光值达到最大值的时间也不一样，浓度越大，达到最大值的时间越短，当酪氨酸酶的量为0．7ml 时，8分钟达到最大值，当酪氨酸酶的量为0．5．0．6ml时，10分钟后吸光值达到最大值，然而，当酪氨酸酶 的量为0．4ml时，12分钟才能达到最大值。 由上述实验结果来看，测定美白剂对酪氨酸酶的抑制率时，提高酪氨酸酶量，可以缩短反应时间， 但是，由于酪氨酸酶价格较贵，增加了实验成本：酪氨酸酶量较底时，反应时间较长，生成的多巴醌很 反应体系的吸光值最合适，可以较为准确地测定美白剂对酪氨酸酶的抑制率