酶联免疫吸附试验检测EDS76病毒抗原的研究.pdf

酶联免疫吸附试验检测EDS一76病毒抗原的研究 王爱华1’2 陈龙宾1苏小庚1孙继国州。 (1河北农业大学动科院保定071001，2河北北方学院动物医学系张家口075000) 检出量约为5ng／孔。通过对EDS-76病毒试验感染鸡脏器带毒、排毒情况和临床样本的检测．表明双夹心ELISA方法 对EDS-76病毒的检测特异性强、敏感度高、经济、方便，适合于成批样本的检测。 关键词：减蛋综合征，双夹心ELISA，HA，抗体 鸡的减蛋综合征(Eggdropsyndrome76，EDS一76)是一种重要的鸡传染性病毒病，它不像其 它疾病一样直接引起鸡死亡影响养禽业，而是以突然、急骤产蛋量下降、蛋壳异常(产软壳蛋、薄 壳蛋、破损蛋等)，蛋体畸形、蛋质低劣而鸡的其他方面均正常为主要特征，给养鸡业造成了巨大的 经济损失u矗1。国内虽已有EDS-76单克隆抗体检测方法的建立，但未见有利用普通高免血清建立本 法的报道，本试验将三株EDS-76病毒高免血清I西混合使用，目的是建立一种快速方法，可敏感、 特异性地检测EDS-76病毒抗原。 1．材料和方法 1．1病毒增殖与纯化： 肾型传染性支气管炎病毒(IBV)均为本实验室保存，鸡胚复壮，无菌收集尿囊液保存备用。 1．2高免血清的制备： 按照刘玉斌口1的方法制备兔抗EDS-76病毒、鸡抗EDS-76病毒血清，用辛 价：紫外分光光度计测定其血清抗体IgG含量。 第一组12只做人工感染试验，第二组6只做对照试验，分开隔离饲养。在感染后第4d、7d、11d、 14d、17d、21d分别剖杀2只感染鸡和一只对照鸡，取其肝、脾、肾、输卵管做为试验样本。将其 其上清液做为ELISA的检测样本。 1．4最佳工作浓度的选择 1．4．1方阵滴定法测定包被抗体和病毒抗原的最佳工作浓度将鸡抗EDS-76病毒抗体(1：10，l： 20，l：40，l：80，h160，l：320，．1：640)用0．05M9．6的碳酸缓冲液稀释后加到聚苯乙烯 pH 200，l：400，l：800，h 微量反应板上包被：抗原做l：100，h 1600倍稀释与上述抗体做方阵 试验。 1．4．2方阵滴定法测定兔抗EDS一76病毒抗体和酶标羊抗兔抗体的最佳工作浓度按照上述滴定的包 500倍稀释，酶标羊抗兔抗体作h500，l：800，1：1000倍稀释做方阵试验。 1．5双夹心ELISA方法的操作程序 u 1．5．1包被：加入pH9．6碳酸缓冲液稀释的鸡抗EDS-76的抗体，100I／孔，4C过夜。甩干包被 液，PBST缓冲液洗涤液洗涤3次，3min／次。 n 1．5．2封闭：加入1％BSA封闭液，100I／孔，37℃60min，甩干；洗涤液洗涤3次，3min／次。 u 1．5．3加样：加入待测样品，100I／孔，每个样品重复3个孔，同时设阳性对照、阴性样品和空白 对照，37℃60min甩干液体，洗涤液洗涤3次，3min／次。 +作者简介：王爱华(1966-)，女，河北省东光县人，在读硕士研究生，从事预防兽医学研究。 木通讯作者：孙继国，教授，E-mail：Sunjigu02000@yahoo．com．cn 143 ll 1．5，4加兔抗EDS-76病毒抗体：用抗体稀释液将兔抗EDS-76病毒抗体1／300稀释，i00I／孔，37 ℃60rain。甩干，洗涤液洗涤3次，3min／次。 lli／孔，37。C 1．5．5加二抗：用抗体稀释液将HRP一羊抗兔IgG按正常工作浓度稀释，i00 60min。甩 干，洗涤液洗涤3次，3min／次。 1．5．6加底物：于各反应孔中加入新配制的0帆0k底物溶液，i00弘l／孔，15min； u1／孑：L，2Ml{2SOt终止反应