蛋白质多重标记讲述.ppt

? 赖氨酸的ε-氨基 ? 一个N端的伯胺 + 20个赖氨酸残基 对于GFP来说 238个 氨基酸 ? FQ如何标记GFP？ 如果标记GFP中所有的伯胺基团？ 理论上可行 而且如果能同时快速标记所有 就不会存在展宽严重问题 但实际这实际非常复杂 在赖氨酸上百个的蛋白质中 这种方法难度太大 无法做到 ? 只标记一个或几个伯胺基团？ 产物会非常多 N个标记位点 会产生2n-1种标记产物 在电泳时 自然泳动速度有差异谱带展宽非常严重 不确定性！！！ ? FQ+蛋白质→FQ蛋白质复合物 FQ蛋白质复合物+FQ→2FQ蛋白质复合物 ······ ? 影响反应的因素： 反应的温度 蛋白质的结构 FQ的浓度 反应时间 。。。 ? 时间： 反应时间越长 与蛋白质结合的FQ越多 蛋白质与FQ生成复合物越多 出峰展宽越严重 ? 如何解决这一问题？ ? THANK YOU 阅读文献 Multiple Labeling of Proteins Design of 3-(4-Carboxybenzoyl)-2-quinolinecarboxaldehyde as a Reagent for Ultrasensitive Determination of Primary Amines by Capillary Electrophoresis Using Laser Fluorescence Detection K inetics and apparent activation energy of the reaction of the fluorogenic reagent 5-furoylquinoline-3-carboxaldehyde with ovalbumin 目录 contents 1 2 3 4 论文主题 研究内容如何支持主题 层次和逻辑 研究方法 5 分析实验数据 6 存在不足 论文主题 TOPIC ? NO.1 论文主题 毛细电泳法测定的蛋白质往往都需要荧光标记,实验发现多重标记的荧光蛋白电泳谱带较天然蛋白的电泳谱带而言明显变宽。 NO.1 论文主题 本文通过观察比较区带电泳法测得天然绿色荧光蛋白和FQ标记的绿色荧光蛋白的谱带，证明多重荧光标记导致谱带变宽并分析其原因。 研究内容支持主题 ? NO.2 研究内容如何支持主题? 文中提出大多数标记蛋白无法区分结合在赖氨酸残基上N末端的胺和组胺，实验通过跟踪绿色荧光蛋白和FQ的反应，发现在10min反应下，标记分子和有多个标记物附着，即多重标记，导致谱带展宽。 层次逻辑 ? NO.3 层次逻辑 开头-- 摘要：介绍了文章的基本内容 介绍了实验研究的背景知识 （如毛细管电泳，荧光标记以及它们可能出现的误差） 引出论文的关键词和大概内容 叙述实验的过程与数据 对数据进行分析和讨论 例举本文得到的肯定，增强文章的说服力 NO.3 层次逻辑 文章脉络清晰，逻辑清楚。 研究 方法 ④ NO.4 研究方法 荧光标记通常用于提高毛细管电泳蛋白质分析的灵敏度。 然而，与天然蛋白质的吸收检测法比较，柱前标签经常导致不良的电泳分辨率。 普遍认为，这一峰展宽来自多个蛋白质标记。大多数标签反应依赖于攻击伯胺的试剂。这些试剂不能有效区分结合在赖氨酸残基上的N末端胺和其他区胺。 标签通常可能会去完成一个产生复杂混合物的标记反应，使得蛋白质的构象变化，然后异构反应产物有不同的迁移率，在电泳过程中蛋白质能带增宽。 NO.4 研究方法 为证明文章所述，通过控制变量来进行试验。 NO.4 研究方法 1、用5 mM硼酸盐和 3.7 * 10-5 M溶解的GFP、1.5mm氰化钠加入100 nmol干FQ配成10微升，分别进行三组然后室温孵化1、5、10分钟。 2、立即稀释4个数量级，以熄灭这个反应。 3、在加上无处理GFP共四种溶液通过氩离子激光然后通过带有硼酸缓冲液未涂覆的毛细管的毛细管带电泳分析。 4、进行分析图谱证明本文观点 分析实验数据 ⑤ NO.5 分析实验数据 运用FQ标记的蛋白，通过不同反应时间（分别为 1min，5min，10min ）的光谱图可知，1min时，分出五个峰，其他时间峰聚集在一起，没有分析意义。 在一分钟的光谱图中，还检测发现检测物流动性与标记物数量呈线性负相关。 NO.5 分析实验数据 综上，得到两点结论 : 一、物质敷浴的时间是导致峰变宽的一个因素，此次实验中一分钟时最佳敷浴时间。 二、标记物的数量会影响蛋白质数量的检测，是导致峰带变宽又一因素 存在不足 ⑥ NO.6 存在不足 1