微生物纯种分离与活菌计数法小论文.docVIP

综合性（设计性）实验 实验报告 实验名称：微生物纯种分离与活菌计数法 姓　　名： 指导教师： 专　　业： 生 物 科 学 实验班级： 实验时间： 实验地点： 微 生 物 实 验 室 成　　绩： 微生物纯种分离与活菌计数法 一.实验目的 1．了解从土壤中分离和纯化微生物的基本原理 2．掌握常用的微生物分离和纯化的方法（涂布平板法、平板划线分离法、稀释倒平板法） 3．学习通过平板菌落进行活菌技术的原理与方法 二.实验原理 自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活 在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养。这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。常用的方法有涂布平板法、平板划线分离法、稀释倒平板法、梯度稀释法等，最终使单个微生物细胞在固体培养基上生长而形成单个菌落，从而获得若干个细菌的纯培养。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其它菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物i，然后分离纯化该微生物，直至得到纯菌株。 三.实验方法 1．梯度稀释法 2．涂布平板法 3．平板划线分离法 4．稀释倒平板法 四.主要实验仪器与材料 1．高压蒸汽灭菌锅、恒温电热干燥箱、生化培养箱 2．器材：酒精灯，电炉，接种环，无菌试管，三角瓶，记号笔，天平，火柴，无菌培养皿，无菌移液管，玻璃涂棒，试管架、无菌生理盐水，盛无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶等。 五.实验步骤 样品微生物的分离 样品的称量：准确称取样品10g 样品的预处理：将称取好的样品10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，摇床约20min，使样品与水充分混合，将菌分散。 样品的稀释：梯度稀释法 取7—8支灭菌空试管，用一支10ml无菌吸管分别加入9ml无菌水。 用一支1ml无菌移液管取从预处理好的样品悬液中吸取1ml注入盛有9ml无菌水中，充分混匀，然后按照以上发法依次稀释成10﹣2﹑10﹣3﹑……10﹣7、10﹣8。 样品微生物的纯化 （1）涂布平板法：用移液枪分别取适合稀释度液1ml于倒好的培养基且凝固好的培养皿中，用无菌涂布棒将稀释液充分涂开，待干。每个稀释梯度一般2—3个平行。 （2）平板划线分离法：用移液管分别取适合稀释度液（一般取3个梯度）于倒好培养基且凝固好的培养皿上按“Z”形划线。 （3）梯度稀释法：用移液管分别取不于同浓度的稀释液，将其均匀分布于平板培养基上。 （4）稀释倒平板法：分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至 45 左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。 培养条件：细菌一般是32.5±2.5℃ 培养时间：细菌2天 样品微生物的计数 首先选取平均菌落数在30-300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数。 六. 实验记录： 适于计数的平板上的菌落数在30-300之间， 细菌稀释度为：104 105 106 放线菌稀释度为：103 104 105 真菌稀释度为：102 103 104 计数时每隔24h统计菌落数，菌落特征包括：形状 大小 颜色 隆起程度等。 七. 实验结果与讨论 制备培养基时，加热溶解琼脂时要不断地搅拌，防止液体剧烈沸腾溢出。 接种操作时尽量避免外界细菌的渗入，使得培养基中菌落参杂了杂菌 划线时应严格按照老师的要求，熟练操作，尽量划线均匀 八． 实验结果： 纯种分离是微生物实验常用的技术，在实验中常常被我们使用。 计数法分为直接计数法和间接计数法。直接计算法常用显微镜技术，但是不能区分死菌和活菌，难以计数微小的细菌。 间接计数法常用的是稀释涂布平板计数，稀释度很重要，一般选用三个稀释度中的第二个稀释度作为最佳，因为平均菌落数为最好。