分子生物学2009-2010-10-研究方法-5-核酸杂交-分子杂交-SNP-芯片.doc

教学单元教案格式 2 第5章研究方法-5-核酸杂交-分子杂交-SNP-芯片 课程教案 授课题目：第5章 研究方法-核酸杂交-分子杂交-SNP-芯片 教学时数： 1.5 授课类型： 理论课 □ 实践课 教学目的、要求： 理解：核酸杂交的原理 SNP的原理 了解：生物芯片的类型、基本制作、应用等 教学重点： 重点阐明：核酸杂交的类型和原理 重点指出：southern 、 northern 、western blotting的流程 教学难点： 绝对难点：三个印迹的操作过程 相对难点：无 教学方法和手段： 老师讲授为主：讲授 视频演示 PPT演示 讨论。以电脑幻灯片边演示边讲述为主，（白板课件）辅以板书（黑板板书） 学生回答问题为辅：（如时间等条件许可的情况下） 注：以下内容按实际需要进行取舍 要求有多媒体，因为信息量大，许多结构图需要媒体放映，效果才好 第讲 1 表型筛选法 (1) 抗药性筛选（插入失活筛选法）： 这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。 通过在抗药性标记上插入外源片段引起该标记所在基因的失活，然后在相应选择性培养基上进行抗药性培养。 (2) 显色反应选择法(α-互补法) 将含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为α-互补。 2 PCR筛选法 利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。 3 免疫筛选法 4 核酸杂交法 将被筛选的大肠杆菌菌落，从其生长的琼脂平板中小心地转移到铺放在琼脂平板表同的硝酸纤维素滤膜上，而后进行适当的温育。取出已经长有菌落的硝酸纤维素滤膜，使用碱液处理，使 DNA变性。然后再用适当的办法处理滤膜以除去蛋白质，留下的便是同硝酸纤维素滤膜结合的变性DNA。变性DNA同硝酸纤维素滤膜有很强的亲全力，这样便形成了菌落的“DNA印迹”。在80℃下烘烤滤膜，以使DNA牢固地固定下来。将这些滤膜同放射性标记的DNA或RNA探针杂交，并通过放射自显影检测杂交的结果。含有同探针互补的DNA的菌落，在X光底片上呈现黑色的斑点（图），通过同原培养基平板上菌落位置的对照，挑选出阳性菌落，便是我们所需要的含有目的基因插入片段的重组体克隆。 （1）原理 带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会在退火时发生互补形成双链的结构 （2）特点 与DNA的来源（物种）无关 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 补充1： 分子杂交种类 1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体 补充2. 按样品制备过程划分 1） 原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交 共同的特点： 原位裂解细胞 不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品 可同时处理大量样品 常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 2. 按样品制备过程划分 2）斑点杂交(dot hybridization)【有视频文件可看】 先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在膜上，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。 不能测定分子量大小。 3）印迹杂交或转移杂交 (blotting hybridization) 先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。 该法可检测出目标分子的分子量。 用于转移的方法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法