第五章 分 子 生 物 学 研2.pdfVIP

第三节 基因克隆的主要载体系统 ? 质粒DNA及其分离纯化 第五章分子生物学研究 ? 重要的大肠杆菌质粒载体 方法 ? λ噬菌体载体 （2） ? 柯斯质粒载体 ? pBluescript噬菌体质粒 一、质粒DNA及其分离纯化 1.大肠杆菌质粒DNA提取 质粒（plasmid):是染色体以外能自主复 制的绝大多数是双链闭合环状DNA分子， 它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝 藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有 质粒存在。目前对细菌质粒研究的较为 深入，在基因工程中，多使用大肠杆菌 质粒为载体。 ? 步骤： ? 准备菌体： – 避免杂菌污染，应在培养基中添加相应的抗 生素。 – 根据不同用途选用不同生长期的菌体。 – 用离心法收集菌体。 ? 细胞裂解： – 采用SDS法 ? DNA的分离抽提。 1 离心后的菌液 1氯化铯密度梯度离心 悬浮 预冷Tris-HCl, pH8.0(葡萄糖，EDTA)溶液 ? 细胞裂解DNA分离中，相对较大的分子 振荡 量的染色体DNA容易发生断裂形成相应 充分分散后的菌液 的线性片断，而质粒DNA则由于其分子 冰水浴5分钟 量较小、结构紧密，因此仍能保持完整 加入NaOH, SDS溶液 状态。 快速混匀 细胞壁破裂，DNA变性 2碱变性 ? EtBr的氯化铯溶液加 到大肠杆菌的裂解 液中， EtBr可以嵌 ? 变性后复性 入DNA链上：