微生物制备壳聚糖酶的研究进展.pdfVIP

工艺技术 I中外食品 ■ 钟超 (国家知识产权局专利局专利审查协作广东中心 广东广州 510530) 摘要：壳聚糖酶是一类催化氨基葡萄糖间的 p-1，4一糖苷键断裂，从而专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶，其催化产物壳寡糖 在保健食品、生物医药等领域具有广阔前景。本文介绍了近些年来壳聚糖酶的研究状况，包括微生物来源、理化性质、分类、 催化机理、分子生物学进展和三种制备方法，提 出并分析 了当前研究中存在的问题 ，最后对今后研究方向作了展望。 关键词：微生物 壳聚糖酶 壳寡糖 发酵 中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1672—5336(2014)10—0002—01 1 973年，Monaghan等在研究细菌和真菌过程中，首 次提出壳聚糖酶的概念。1992年壳聚糖酶被系统命名 为EC3．2．1．132。2004年，国际酶委员对壳聚糖酶重新 定义为：一类催化氨基葡萄糖间的p一1，4一糖苷键断 裂，从而专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶，壳聚糖酶 的发现可克服壳聚糖生产成本高和溶解性的缺陷，从 而转化为溶解性更优越、溶液稳定性更强、生物活性 更丰富的壳寡糖，这就成了现今研究的热点方向。作 者结合近年来国内外壳聚糖酶的研究成果，综合分析 了壳聚糖酶的分类、性质和制备方法等研究现状。 1壳聚糖酶概述 壳聚糖酶目前有3种分类方法【]】：底物专一性差别和 酶的产生特点。根据底物专一性差别，壳聚糖酶可以分 为三类，第一类可以水解GIcN-GlcN键及GlcNAc—GlcN 键；第二类只能水解GlcN—GlcN键；第三类既可水解 GlcN-GlcN键，又可水解GlcN-GlcNAc键。根据酶的产生 特点，可以将壳聚糖酶分为组成型和诱导型。 壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，其最适pH值范围一般 在4．0～8．0。酶的等电点(pI)变化范围大多集中在4．O～ 1 0．1。壳聚糖酶具有较好的热稳定性，最适反应温度在 30～60C。研究发现金属离子尤其是重金属离子对壳聚 糖酶活性有不同程度的影响。大部分壳聚糖酶属于内切 酶，降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物， 壳聚糖酶在酶解过程中的活性是随着N一乙酰化度、 N一取代基团及其不同取代位置以及均相和非均相反 应体系而变化的。 2壳聚糖酶的微生物制备方法 2．1微生物液体发酵 目前研究公认大多数微生物来源的壳聚糖酶属于 诱导酶，因此当以壳聚糖作为唯一碳源时，微生物的 产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。一般的液体发酵 步骤是通过平板分离初筛和摇瓶培养复筛，从土壤中 筛选出产壳聚糖酶菌株，然后经酶活力检测比较，挑 选出产酶能力最强的菌株作为产酶试验菌。当然也可 通过人工诱变处理来获得高产突变株，最常用的方法 是化学法和物理法诱变，可采用单因子诱变处理和复 合因子处理。目前对于壳聚糖酶的分离纯化方法主要 有(NH ) SO 分级盐析、Q-Sepharose Fast Flow阴离 子交换 gepfiacry S-IO0凝胶过滤分离等方法。酶活单 位定义为每分钟催化生成相当于1 t． tool氨基葡萄糖 的还原糖所需的酶量。测定壳聚糖酶最常用的方法是 DNS法，此外还有粘度法快速测定法和铁氰化钾显色 法。对已筛选出的产壳聚糖酶菌种的鉴定一般包括① 形态学特征鉴定 ；②生理生化特性鉴定 ；③l6S rDNA 序列分析 。由于壳聚糖酶的稳定性不高 、寿命短、且无 法循环使用，在生产中的应用受到了极大限制，但是 通过固定化后上述缺点都可以解决。 2．2丝状真菌固态发酵 工业上固态发酵是生产酶制剂的主要方式，对于 菌丝体有利于保持其自然生理状态和生长，所用培养 基和发酵条件更加低廉和简单，而且投资较少；纯化 步骤少，产品纯度高，是丝状真菌的一种理想培养方 法，糖化工业中以常见的根霉菌丝体替代纯壳聚糖为 诱导原料。 2_3基因工程育种 除了在自然界中继续筛选产酶活性较高的微生物 菌种外，现在越来越多的研究人员利用基因工程通过 对产壳聚糖酶菌株的基因分析，运用分子方法克隆并 高效表达所选菌种的壳聚糖酶基因，以实现重组菌的 壳聚糖酶高效表达，具体技术路线如下：根据所选菌 株壳聚糖酶基因序列或参照其他菌株的壳聚糖酶基 因序列一PCR引物设计，引物合成一提取所选菌株总 DNA—PCR扩增获得目的基因一构建原核表达载体 一 重组菌高效表达条件研究一壳聚糖酶高效表达。 3研究展望 继续筛选产酶活性较高的微生物菌种的过程中， 要合理运用新的诱变方法或进行复合诱变，以减小菌 种对诱变方法的抗性，从而获得高产菌株。另外，对发 酵条件也要进行优化和改进，筛选出最佳产酶条件， 以获得最大的产酶量。另一方面，应该紧跟国际前沿， 进一步在分子水平上研究壳聚糖酶的分子结构和作 用机制，以便更有效地克隆细菌壳聚糖酶基因，构建 能高效表达壳聚糖