鹽析法快速分離鸡蛋清卵白蛋白的初步研究.docVIP

盐析法快速分离鸡蛋清卵白蛋白 2 摘要：鸡蛋清原液用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液稀释5倍，4℃下静置至少6 h，采用30%～80%不同饱和度的硫酸铵分离卵白蛋白，采用Bradford法测定盐析后蛋白含量，SDS检测其纯度，结果表明，60%饱和度的硫酸铵分离鸡蛋清卵白蛋白效果较好。 关键词：盐析法；鸡蛋清；卵白蛋白 鸡蛋中含有丰富的生命必需元素，营养价值较高。随着对鸡蛋生理生化活性研究的不断深入，对鸡蛋的利用逐渐超越简单的初加工阶段，趋向于开发具有较高附加值的生理活性物质[1-2]。蛋清是一种以水为分散介质，以蛋白质为分散相的典型胶体物质，鸡蛋清中的蛋白质含量约为总量的11%，除不溶性的卵黏蛋白外，均为可溶性蛋白质。卵白蛋白、卵铁传递蛋白和溶菌酶是其中3种主要的生物活性蛋白质。 卵白蛋白是蛋清中主要的活性蛋白，约占蛋清蛋白质含量的54%。卵白蛋白具有许多功能特性[3]，例如，卵白蛋白对胰蛋白酶有强烈抑制作用，能部分抑制枯草杆菌蛋白酶活性[4]；Fujita用胃蛋白酶水解卵白蛋白，并用RP-HPLC分离出具有血管舒张活性的物质OA358-365[5]；Davalos和Xu等研究发现，卵白蛋白酶降解物具有强抗氧化活性的多肽[6-7]。卵白蛋白是生物化学中一种重要的参考蛋白质，包含所有的必需氨基酸，而且比例合理。高度纯化和结晶的卵白蛋白可以作为载体、稳定剂、封阻剂或标准物等，也可作为营养添加剂应用于食品工业。虽然许多学者对卵白蛋白进行了大量研究，但对其生物学特性和功能的了解仍不够全面，本文采用硫酸铵盐析的方法，对鸡蛋清中的卵白蛋白进行了快速初步分离，为其进一步开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 新鲜鸡蛋，购自超市；卵白蛋白标准品，Sigma公司；硫酸铵分析纯，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；透析袋，Amersham Bioscicnccs(SF)Corp。 1.2 试验方法 1.2.1 鸡蛋清原液的制备 取新鲜鸡蛋，用双层灭菌纱布过滤得到水样成分，充分搅拌30 min（搅拌剧烈程度以不起泡沫为准）。为了降低鸡蛋清粘度以利于后续试验，取5 mL鸡蛋清用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液（50 mL 0.1M Tris-base溶液与5.7 mL 0.1M HCl溶液混匀后，冷却到室温，加水定容到100 mL）进行5倍稀释，4℃下静置至少6 h。 1.2.2 鸡蛋清卵白蛋白盐析法分离 将静置蛋清4℃、10000 rpm离心10 min，取上清液，缓慢多次加入烘干研磨成粉末的硫酸铵，磁力搅拌，使加入粉末溶解，并参考硫酸铵溶液饱和度计算表，使其饱和度分别达到30%、40%、50%、60%、70%和80%。4℃静置过夜，于4℃、12000rpm离心10 min，不同饱和度离心所得沉淀均用pH 9.0的Tris-HCl缓冲液溶解，并在4℃、0.05 M的Tris-HCl缓冲液中进行透析。期间更换透析液2~4次，透析过夜。 1.2.3 蛋白质检测 蛋清盐析蛋白质含量采用Bradford法测定[8-9]：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色，蛋白与考马斯亮蓝反应后，溶液在分光光度计波长595 nm处吸光度与蛋白质含量成正比。用BSA蛋白标准液在波长595 nm处测得的吸光值绘制标准曲线（见表1），不同饱和度盐析得到的蛋白样品在595 nm波长测得的吸光值，通过标准曲线得到蛋白含量。采用SDS检测盐析后卵白蛋白的纯度。 表1 标准曲线配比表 处理序号0.01%BSA标准液（μL）蒸馏水（μL）考马斯亮蓝（μL）蛋白质含量（μg/mL）10200100002401601000203801201000404120801000605160401000806200010001002 结果与分析 2.1 蛋白含量检测 根据不同浓度BSA蛋白标准液在波长595 nm处测得的吸光度（表2）绘制标准曲线（图1）。由表2可知，30%硫酸铵饱和度盐析能沉淀较多的杂蛋白，经60%饱和度硫酸铵盐析后蛋白质的SDS电泳条带与卵白蛋白标准品一致，70%和80%饱和度硫酸铵盐析能沉淀较多的目的蛋白，但杂蛋白较多，需要进一步纯化。 图2 蛋白质含量标准曲线请提供本图的Excel文件 表2 样品中蛋白质含量 硫酸铵饱和度（%）蛋白量含量（μg）回收率（%）302818.89.3640447214.865017215.7160542418.02701331044.22804468.814.85总蛋白30110- - -2.2 卵白蛋白的分离 SDS检测盐析后卵白蛋白的纯