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　　STAT3蛋白在喉癌组织中的表达的论文 【摘要】 目的 探讨stat3在喉癌组织中的表达及意义。方法 采用免疫组织化学法和rt－pcr 检测stat3蛋白及 mrna 在喉癌组织中的表达情况。结果 免疫组织化学检测发现30例喉癌组织标本中有23例stat3高表达,而8例正常组织中有2例低表达（plt;0.05）,6例未表达；rtpcr检测stat3 mrna的表达结果显示30例喉癌组织中21例呈高表达,相应的正常组织2例为低表达（plt;0.05）。结论 stat3高表达于大多数喉癌组织中,较正常组织表达明显升高，提示stat3的表达可能与喉癌的发生、发展密切相关。 【关键词】 stat3 喉肿瘤 基因表达 stat3是在研究ifn信号转导机制的过程中发现的一种转录因子,可以在外界信号的刺激下激活并直接转入细胞核内引发相应靶基因的转录,是一种信号转导子和转录激活子(signal transducers and activators of transcription, stat)[1]。近年来研究发现, stat3具有强烈抑制??胞凋亡、促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演进[2]。本研究采用rt－pcr和免疫组织化学的方法检测stat3在喉癌组织中的表达，探讨其在喉癌发生发展中的作用。 1 资料与方法 1.1 资料来源 标本取自2003年1月～2004年7月华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻喉科手术切除的喉癌组织标本，共30例。.所有病例均是首次手术，术前均未行放、化疗，术后均经病理检查诊断为喉鳞状细胞癌。其中男26例,女4例;年龄49～74岁,平均59.6岁。另选8例正常喉黏膜组织标本为对照组。所取组织标本分为2份,一份石蜡包埋,用于免疫化学检测;另一份半小时内储存于-70℃深低温冰箱用于rtpcr检测。 1．2 主要试剂 trizol 购自美国invitrogen公司，逆转录试剂盒及taqdna聚合酶均购于美国fermentas公司。兔抗人stat3单克隆抗体购自美国santa cruz公司；sp免疫组化试剂盒购自北京中杉生物工程有限公司。hep2细胞系来源于人喉鳞状细胞癌，购于武汉中国典型培养物保藏中心（ctcc）。 1. 3 免疫组织化学染色 链霉素抗生物素蛋白过氧化酶法(sp)检测喉癌组织中stat3的表达：采用sp染色试剂盒,染色方法严格参照其说明书进行。使用微波抗原热修复,抗原修复液为ph 6.0的枸橼酸缓冲液, pbs缓冲液代替一抗作阴性对照，抗体工作浓度为1∶100，经dab 显色,苏木精对比染色后,中性树胶封片。stat3染色结果的判断：胞浆或胞核呈棕黄色为阳性。 1．4 rtpcr 取存放于-70℃冰箱的喉癌组织以及正常喉组织各约50 mg左右，同时取经过复苏培养的喉鳞癌细胞株hep2 10μl,匀浆后加trizol试剂0.6ml,同样按trizol试剂使用说明抽提总rna。使用逆转录试剂盒逆转录酶合成cdna 链。pcr引物序列由应用软件primer 5.0设计,然后由上海生工公司合成。stat3:5′gtcagatgccaaatgc 3′（上游）; 5′cctggaggcttagtgc3′ （下游）,长度为409bp。βactin： 5′tgtacgttgctatccaggct3’ （上游），5′ctccttaatgtcacgcacga3’ （下游），长度为248bp。pcr反应体系(总体积25μl): h2o 16μl, 10mmol/ l dntp 1μl, 25mmol/l mgcl2 2μl, 10×buffer 2.5μl、上,下游引物各0.5μl, cdna 2μl, taq酶0.5μl。pcr 条件: 预变性94℃ 5min; 94℃ 45s;53℃ 45s; 72℃ 1min; 36个循环; 延伸72℃ 10min。反应结束后取5μl 产物用1.5%琼脂糖凝胶(内含嗅化乙啶) 电泳,紫外灯下观察并用凝胶成像系统成像。 1．5 stat3染色结果的判断 胞浆或胞核呈棕黄色为阳性，在不同位置取10个高倍视野（×200），记录每个视野100个细胞中阳性染色细胞个数，计算阳性百分率取平均值。肿瘤细胞着色率0～5％为“-”；肿瘤细胞着色率≥6％为“+”。 1．6 统计学处理 所有数据应用spss10.0软件进行统计学处理，根据实验资料要求，选用独立样本的t检验进行数据分析，以plt;0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 stat3在喉癌和正常喉组织中的表达 stat3蛋白阳性信号主要位于细胞浆中,少数位于细胞核。 喉癌组织中stat3蛋白的阳性表达率为76.7%(23/30),正常喉组织中阳性率为25.0%(