TFPI2基因克隆及其在胰腺癌细胞中的表达的论文.docVIP

　　TFPI2基因克隆及其在胰腺癌细胞中的表达的论文 【摘要】 目的 克隆人tfpi2基因全长cdna，构建其真核表达载体，并将其转染到人胰腺癌细胞panc1中，检测其表达。方法 用rtpcr法从人胎盘组织中扩增人tfpi2基因，并将其与真核表达载体pegfpc1连接，构建真核表达载体pegfpc1tfpi2。将构建的重组载体转染到人胰腺癌细胞系panc1细胞，atrix,ecm)结构完整以及调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。.cOm我们通过克隆人tfpi2基因、构建其真核表达载体，并将其转染胰腺癌细胞系，以便进一步探讨其对胰腺癌细胞生长、浸润及转移的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 人胰腺癌细胞系panc1购自中科院细胞库；dmem培养基购自hyclone公司；rna 抽提试剂 trizol regent 购自 gibco brl 公司；rtpcr 试剂盒购自promega 公司；dna 聚合酶 pfu、dntp 购自申能博彩公司；限制性内切酶ecorⅰ和salⅰ、t4dna连接酶购自 neb 公司；质粒抽提试剂盒、dna 凝胶回收试剂盒购自华舜公司；大肠杆菌dh5α、质粒pegfpc1由本实验室保存；pcr system 2400 pcr 扩增仪购自 pe 公司；smartspec 3000 分光光度计购自 biorad 公司；lipofectamine2000转染试剂盒购自invitrogen，多克隆抗兔tfpi2抗体，辣根过氧化物酶（hrp）标记兔抗鼠igg，单克隆鼠抗gapdh，dba显色试剂盒购自santa cruz公司。 1.2 方法 1.2.1 引物设计合成 人tfpi2基因的特异性引物由宝生物工程（大连）合成，在上游引物和下游引物的5′端分别引入ecorⅰ和salⅰ的酶切位点（下划线序列）。上、下游引物序列分别为：5′cagaattctatggaccccgctcgcccc3′和5′cagtcgacttaaaattgcttcttccg3′，扩增产物大小为708bp。βactin作为内参照，上、下游引物分别为5′gctcgtcgtcgacaacggct3′和5′ caaacatgatctgggtcatcttctc3′,扩增产物为353bp。 1.2.2 rtpcr扩增目的基因tfpi2 取新鲜胎盘组织，切成小块立即放入液氮冻存。在液氮中将组织研碎，取约100mg按照trizol试剂说明提取总rna，经凝胶电泳和紫外分光光度计分析后，按promega公司 rna pcr kit 说明书操作，两步法rtpcr，先逆转录制备单链cdna，再以逆转录产物为模板，用上、下游引物进行 pcr反应扩增目的基因，反应条件：95℃预变性5min，然后 94℃变性30s，56℃退火 30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温。扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.2.3 真核表达载体pegfpc1tfpi2的构建及鉴定 pcr产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后，进行ecorⅰ和salⅰ双酶切反应，用1%琼脂糖凝胶电泳回收，再与经同样处理的质粒pegfpc1进行连接反应。取感受态大肠杆菌200μl，加10μl连接产物，冰浴10～30min。热激37℃×5min或 42℃×90s，加1ml lb培养液，振荡培养37℃×200r/min×60min,吸取 200μl 菌液涂布含筛选用抗生素的lb平板。37℃静置培养 12～16h，待其长出单克隆菌落。挑取阳性克隆扩大培养，质粒提取试剂盒提取少量提取质粒进行限制性酶酶切鉴定，并测定dna序列。测序正确后命名为pegfpc1tfpi2。 1.2.4 细胞培养及转染 panc1细胞用含10％胎牛血清的dmem培养基于37℃，5％co2的培养箱传代培养。将传代后培养3天的panc1细胞接种于12孔培养板，按照lipofectamine2000说明书分别将重组质粒pegfpc1tfpi2和空载体pegfpc1转染到panc1细胞，同时以未转染细胞做对照。转染48h后用含有g418的dmem培养基选择培养，待抗性细胞克隆形成后，扩大培养，继续用g418筛选得到稳定传代的转染细胞系。 1.2.5 荧光显微镜检测荧光蛋白表达 将稳定转染的panc1细胞置于倒置荧光显微镜，观察绿色荧光的表达。 1.2.6 ）蛋白[1]，测定蛋白浓度，制备12％的sdspage凝胶，并进行蛋白质电泳，电泳分离后，恒压转移到pvdf膜上，用含5％脱脂牛奶的tbst缓冲液封闭，4℃过夜。tbst 1∶2 000稀释抗tfpi2多抗，室温培育1.5h，tbst洗5次，再用hrp