survivin在人宫颈癌前病变和宫颈浸润癌组织中的定量分析的论文.docVIP

　　survivin在人宫颈癌前病变和宫颈浸润癌组织中的定量分析的论文 【摘要】 目的 检测survivin在人宫颈癌前病变和宫颈浸润癌组织中的表达，探讨其与宫颈癌发生发展的关系，评估其临床应用价值。方法 采用免疫组化技术和实时荧光定量pcr技术检测30例宫颈浸润癌、15例癌前病变和10例宫颈炎组织中survivin的表达。结果 （1）survivin蛋白和survivin mrna在宫颈炎组织中仅微量表达，在宫颈癌前病变和宫颈癌组织的表达依次显著增强（p＜0.05和p＜0.01）, survivin mrna在宫颈癌前病变和浸润癌组织中的表达量分别是宫颈炎组的11.0倍和22.6倍。（2）在宫颈癌前病变、宫颈浸润癌组织中survivin mrna和蛋白两者的表达量均呈正相关（p=0.02和p=0.01），而在宫颈炎组织中两者无明显相关性。结论 survivin与宫颈癌的发生发展密切相关，是一个具有重要临床意义的特异性肿瘤标记物，应用实时荧光定量pcr技术检测survivin可做为宫???癌早期诊断的可靠方法。 【关键词】 survivin 宫颈癌 癌前病变 实时荧光定量pcr 疫组化 survivin蛋白是目前发现的作用显著的凋亡抑制因子，以杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列（baculoviral iap reapeat, bir）与caspase3、7、9结合抑制细胞凋亡，并定位于着丝点和中心纺锤体上而发挥调控细胞周期的作用[1，2]。.survivin蛋白在多种恶性肿瘤中过量表达，与肿瘤的发病、侵润及预后密切相关，survivin蛋白在宫颈癌中过量表达已经免疫组化法证实，但其复杂的功能与亚细胞定位的关系仍未阐明，另外， survivin mrna在宫颈癌及其癌前病变组织中的定量检测，及其能否在转录水平上调控survivin蛋白的表达仍待研究。本研究采用免疫组化法和实时荧光定量pcr技术检测宫颈癌和宫颈癌前病变中survivin mrna和survivin蛋白的表达，以期评估survivin作为一个肿瘤特异性因子在宫颈癌早期诊断及预测患病危险度中的价值。 1 资料和方法 1.1 资料 1.1.1 标本来源和处理 所有标本均取自三峡大学第一附属医院妇科住院部手术病例和门诊阴道镜室病理活组织检查病例，包括10例宫颈炎组织、15例癌前病变组织和30例宫颈浸润癌组织。患者之前均未做过放化疗。所有标本均由病理科确诊，按组织学分级：高分化5例， 中分化15例， 低分化10例。临床分级按figo1995年标准：30例宫颈癌病例均为磷癌，其中ⅰ期 14例，ⅱ期16例。三组的平均年龄为47岁。标本离体后立即分为两份，一份放入液氮中速冻，然后移至-80℃冰箱保存待用；另一部分置于10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片。 1.1.2 主要试剂 即用型survivin多克隆抗体和sabc免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司,实时荧光定量pcr相关试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。 1.1.3 引物和探针 survivin(nm_001012271)探针和引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。survivinf:5′aacactgctgtggaccctact3′, survivinr：5′gacaactgcgtctctg cca g3′, survivinp：5′(fam)catcctcactgcggctgtctgggc (eclipse)3′, 扩增片段长度为129bp。gapdhf:5′ccaggtggtctcctctgactt3′,gapdhr：5′gttg ctgtagccaaat tcgttgt3′，gapdhp：5′（fam）aacagcgacacccac tcctccacc（eclipse）3′, 扩增片段长度为130bp。 1.2 方法 1.2.1 免疫组化 1.2.1.1 免疫组化sabc法检测survivin蛋白的表达 切片常规脱蜡水化,微波修复10min,严格按照试剂盒说明书进行操作,用已知阳性片作为阳性对照，将磷酸盐缓冲液代替一抗做为阴性对照。 1.2.1.2 免疫组化染色特征和图像分析 survivin阳性染色判断：以出现淡黄色至深棕黄色为阳性，见图1、2。运用leica q500i iod）。 1.2.2 实时荧光定量pcr法检测survivin mrna表达 1.2.2.1 总rna提取和cdna合成 严格按trizol说明书提取组织总rna，所提取的总rna通过a280/a260比率检测其纯度；经1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见明显的28s、18s两条带,证明其完整性。之后立即进行反转录，反应体系为25μl，取11μl总rna中与1