酵母表达系统选编.pptVIP

真菌基因工程;三 酵母表达系统;（一） 酿酒酵母表达系统;1、酿酒酵母启动子;1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH;2）半乳糖激酶启动子（GAL1）;2）半乳糖激酶启动子（GAL1）;3）pho4TS-PHO5启动子;酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL ;*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用 *信号肽结构： ;*分泌效率高 *在酵母系统具有通用性 *88个残基组成 ;糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖 基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。 O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化 ;* 过糖基化（超糖基化修饰）： N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成 O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团;1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵 2）分泌表达产物过糖基化;（二） 甲醇酵母表达系统;1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子;1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子;1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子;1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子;2、甲醇酵母表达系统的优缺点;3、甲醇酵母表达系统操作原理;甲醇酵母系统宿主;甲醇酵母系统宿主;甲醇酵母系统宿主;甲醇酵母系统的整合事件;毕赤酵母系统模式表达载体;1）AOX1位点插入;2）His4位点插入;3） 多基因插入事件（串联整合）;4） 基因取代（GS115，AOX1+）;汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体;甲醇酵母系统胞内表达载体;甲醇酵母系统胞内表达载体;甲醇酵母系统分泌表达载体;甲醇酵母系统分泌表达载体;甲醇酵母系统分泌表达载体;4、甲醇酵母系统高效??达影响因素与对策;1）载体稳定性;2）基因剂量;3）整合位点;5）mRNA5’端;7）分泌信号;8）表达产物稳定性 分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素 降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低 培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制 采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168