蛋白质的提纯和测试.docVIP

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蛋白质的提纯和测试

蛋白质的提纯与测试 在上生物化学课的过程中我对蛋白质的提纯与测试这一方面非常的感兴趣。蛋白质是人体一切细胞组织的重要成分,是生命现象的物质基础,因而具有重要的生理学意义。对蛋白质的提纯与测试在蛋白质的合成,食品安全,药物的合成,生活污水的处理,动植物的研究等研究领域有着相当重要的作用。我查找了相关的文献,使我对蛋白质的提纯与测试的方法有了更深入的了解,以下是我对这些方法的总结。 一,蛋白质的提纯 1 根据溶解度不同分离纯化 蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。同一特定条件下,不同的蛋白质有不同的溶解度,可以此达到分离的目的。 1.1 盐析法:中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析沉淀分离后,需要除去蛋白质中的盐,常用透析法、凝胶过滤层析法。此法条件温和,操作简单。 1.2 有机溶剂沉淀法:用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。张跃林[ 1 2 ]用缓冲液、乙醇提取,冰丙酮沉淀等方法提取蚱蜢得到不同类型的蛋白质。 1.3 等电点沉淀法:蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,很多蛋白质的等电点在偏酸性范围(如血清蛋白的等电点在4.9),以无机酸调节pH,价格低,操作较方便。但对低pH 敏感的目的蛋白质应避免使用此法。 1.4 聚乙二醇沉淀法:许多相对分子质量高的非离子聚合物如聚乙二醇、葡聚糖等均可沉淀蛋白质。聚乙二醇无毒,不可燃,操作条件温和、简便,沉淀较完全且对蛋白质有一定的保护作用。此法常用于浓缩蛋白质溶液。 2 根据带电性质分离纯化 2.1 离子交换色谱法:基于不同蛋白质在一定条件下电荷种类、数量及分布不同,表现出与离子交换剂结合强度的差异从而实现分离。离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素)。 2.2 电泳法:各种蛋白质在同一条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。 常用的电泳法是聚丙烯酰胺凝胶电泳,包括常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。此外,等电聚焦电泳、双向电泳、毛细管电泳等也被广泛应用。 3 根据配体特异性的分离方法—亲和色谱法 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合。 4 根据分子大小分离纯化 4.1 凝胶过滤色谱 该法蛋白质相对分子质量大小的差异进行洗脱分离,在蛋白质研究中可用于脱盐、蛋白质的分级分离等。滕晓春等[3]将盐析法与Sphadex G-200凝胶层析相结合分离小鼠甲状腺球蛋白,结果表明,经2次层析可获得高纯度的甲状腺球蛋白。 4.2 超滤法 在离心力或较高压力下,选择适当孔径的半透膜(膜孔径1~20 nm),截留所需的大分子蛋白质,从而实现分离。刘爱国等[14]选取硫酸铵盐析法、超滤法及盐析- 超滤结合法,从牛血清中得到免疫球蛋白粗提物。结果显示以盐析-超滤结合法分离效果最佳。而后利用凝胶层析法纯化分离得到的牛血清免疫球蛋白,并用SDS鉴定了蛋白质纯度。 5 共价色谱 应用固定相与溶质之间共价键的形成或断裂实现分离。现今的共价色谱通常是利用巯基的二硫相互作用分离含巯基蛋白质。 蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离,提纯和鉴定是生物化学中的重要的一部分,至今还没有单独或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用。 二 蛋白质的测试 1.Folin-酚法 此法分两步(1)在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原,混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100倍,定量范围为5~100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物,均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响,即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同,标准曲线也

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