水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达.docVIP

　　水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达 作者：武云涛 李祎 朱庆三 刘景臣 【摘要】 目的 研究急性实验性脊髓不完全损伤水通道蛋白4(AQP4)的表达 规律 ，探讨脊髓水肿的分子生物学机制。方法 建立兔急性脊髓不完全损伤动物模型，采用免疫组化方法、RTPCR检测脊髓损伤术后6 h、1、3、5和7 d时AQP4蛋白及其mRNA的表达变化。结果 脊髓损伤后AQP4及其mRNA表达即开始增加并持续上升，伤后3 d达到高峰，以后逐渐减少，二者的表达变化呈显著正相关。结论 AQP4参与了脊髓损伤后水肿的形成过程，AQP4过度表达可能是损伤性脊髓水肿的分子生物学机制之一。 【关键词】 水通道蛋白4；免疫组化 RTPCR；脊髓损伤；脊髓水肿 急性脊髓损伤(acute spinal cord injury，ASCI)临床上常见，常致终生瘫痪，并引起各种并发症甚至死亡。 　 　2 结果 　　2.1 损伤脊髓的表达 　　对照组脊髓AQP4在灰质和白质均有表达。脊髓灰质阳性细胞主要为神经胶质细胞，细胞膜呈棕黄色，顺中央管排列的室管膜细胞表达呈弱阳性，中央管室管膜周围、血管周围表达强烈，邻近毛细血管内皮细胞和神经元的胶质细胞突起表达亦非常丰富，神经元未见着色。脊髓白质内的纤维性星形胶质细胞、脊髓表面软脊膜也呈阳性表达，以邻近蛛网膜下腔和面向毛细血管内皮细胞的胶质细胞表现得更加突出。损伤早期中央管周围和后角染色较深，随着时间的延长损伤部位及其周围的水肿区AQP4表达明显增强，而脊髓中央出现坏死、空泡形成的区域反而表达减弱，甚至无表达。实验1组，AQP4表达开始增加。实验3组，AQP4表达在损伤脊髓的水肿区达高峰，尤其在血管周围表达强烈，呈深棕色。随时间延长AQP4表达又逐渐减弱，实验5组表达仍稍高于正常水平。AQP4阳性表达主要位于损伤周围水肿区星形胶质细胞的细胞膜上，而胞浆及胞核未见阳性表达，镜下AQP4阳性细胞呈空泡状。 　　2.2 AQP4染色OD值及AQP4mRNA的表达变化 　　SCI后脊髓灰白质中均可见到AQP4表达明显增加。与对照组相比，实验1至5组脊髓损伤区OD值均有显著差异(表1)。RTPCR测定实验组中AQP4mRNA的表达显示：AQP4 mRNA扩增条带为214 bp，表达均呈阳性，与AQP4的表达相似；实验1组AQP4 mRNA开始表达上调，实验3组达到高峰，以后逐渐减轻，实验5组仍高于对照组水平(图1)，并且均有显著差异。线性回归分析结果显示，急性脊髓不完全性损伤后AQP4与其mRNA表达变化呈显著正相关(r=0.943，P＜0.05)。表1 急性脊髓不完全性损伤AQP4及AQP4mRNA的表达变化(略) 　 　　 3 讨论 AQP在脑脊髓中含量丰富，在脊髓水肿的形成和消退中起重要作用。Oshio等〔3〕通过RTPCR方法对AQPs表达，研究发现AQPs有四种亚型在正常成年大鼠脊髓内表达，AQP4表达最为强烈，而且证实AQP4在成年老鼠脊髓内主要位于灰质的神经胶质细胞和脊髓白质星形胶质细胞的血管周足上。本研究采用改良Allen法建立兔急性不完全性脊髓损伤模型。首先，观察到AQP4在对照组脊髓中的分布特点为：AQP4在灰质的分布明显多于白质，主要为神经胶质细胞的细胞膜着色，脊髓中央管周围、软脊膜以及血管周围呈极性分布，邻近蛛网膜下腔、毛细血管内皮细胞和神经元的胶质细胞突起表达非常丰富。AQP4分布特点充分反映其与脊髓水转运密切关系。本研究也发现AQP4及其mRNA在脊髓损伤后的表达是一个动态的变化过程，免疫组化从蛋白水平证实了AQP4表达于脊髓损伤6 h即开始增加，第3 d达到最高水平，随后开始下降，7 d时仍高于对照组。RTPCR结果又进一步从基因水平证实了AQP4的变化趋势与其蛋白含量变化相一致。Saadoun 等〔4〕实验表明，脊髓损伤后AQP4野生型(AQP4+/+)小鼠比AQP4基因敲除(AQP4/)小鼠出现更严重的肢瘫，脊髓损伤48小时后AQP4/小鼠神经细胞凋亡、髓鞘液化、脊髓肿胀、脊髓实质内压力等指标都较前者轻微。因此提示AQP4提供途径使过量的水分进入脊髓损伤区，从而引起脊髓水肿、脊髓压力升高。 本实验推论脊髓继发性损伤脊髓组织水肿的病理机制之一可能是损伤诱发了血脑屏障的星形胶质细胞胞膜上AQP4的表达，促进了水肿液能迅速通过毛细血管进入神经组织间隙所造成的。可以认为，发生中枢神经组织水肿时AQP4表达增加是星形细胞适应细胞外环境变化的反应，同时AQP4的过度表达又促进了星形细胞水肿的发生和 发展 ，而AQP4表达的下调或缺无对减轻神经组织水肿程度、降低死亡率和致残率有重要作用。这一现象对人类高发病率、高死亡率SCI脊髓水肿的 治疗 有重大意义，提示AQP4