红花黄色素对家兔缺血再灌注心肌超微结构和细胞凋亡及bcl2、bax蛋白表达的影响.docVIP

　　红花黄色素对家兔缺血再灌注心肌超微结构和细胞凋亡及bcl2、bax蛋白表达的影响 作者：徐传金 张文忠 冯培青 蔡尚郎 【摘要】 　　目的 通过在体兔心肌缺血再灌注模型，研究红花黄色素对家兔缺血再灌注心肌超微结构和细胞凋亡及bcl2、bax蛋白表达的影响。方法 24只新西兰大白兔随机分为3组：缺血再灌注组（IR组），红花黄色素组（SY组），药物组（MI组），每组8只。实验终末，取缺血坏死区心肌在光镜、电镜下观察心肌细胞凋亡状况，并且检测bax和bcl2蛋白在心肌细胞中的表达水平。结果 与IR组相比，SY组能减轻缺血心肌超微结构的改变，并通过上调bcl2、下调bax表达抑制细胞凋亡。结论 红花黄色素能产生心肌保护作用，RISK信号转导通路可能参与了这一过程。 【关键词】 红花黄色素；缺血再灌注；细胞凋亡；bcl2；bax 　　红花黄色素（saffloin耳缘静脉注射SY 10 mg/kg，余同IR组。药物组(MI组)：于再灌注前5 min耳缘静脉注射磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002（0.3 mg/kg），余同SY组。 　　1.2 方法 　　1.2.1 心肌缺血再灌注模型制备 　　采用乌拉坦（1 g/kg）耳缘静脉注射麻醉。仰卧位固定，心电图导线与兔四肢相连，记录12导联心电图，连接心电监护。除毛，沿胸骨正中偏左0.5 cm切开皮肤，暴露左侧3、4肋骨，钝性分离肋间肌，小弯钳于肋下穿10号缝合线2根，分别结扎，沿结扎线正中剪断3、4根肋软骨；牵拉两侧结扎线，暴露胸腔，分离脂肪组织，可见心包及搏动之心脏。提起心包膜正中，用眼科剪将心包膜前部剪开,将心包膜用缝线固定于胸壁，充分暴露心脏。用止血钳将左心耳轻轻提起，观察冠脉的走行。以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2 mm处，用持针器持小圆针在冠状动脉前降支根部穿一结扎线，结扎线穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁穿出；在该结扎线下方约0.5 cm处再穿一结扎线，双重结扎左前降支1 h，再灌注6 h。心电图胸前导联出现ST段弓背向上抬高为结扎成功。 　　1.2.2 心肌细胞光镜学观察 　　各组动物于再灌注末取缺血坏死区心肌组织行苏木素伊红（HE）染色，观察心肌细胞形态学改变。实验步骤如下：取材→固定→脱水和透明→透蜡→包埋→切片及贴附→脱蜡复水→染色→水洗→分化→漂洗→复染→透明→封藏，切片经中性树胶封藏，等树胶干后就可在镜下进行观察。 　　1.2.3 心肌细胞电镜学观察 　　各组动物于再灌注末取缺血坏死区心肌组织进行超薄切片观察心肌细胞超微结构改变。实验步骤如下：①取材：取缺血再灌注区组织，制成1 mm3的组织块；②2.5%戊二醛4℃固定4 h；③磷酸缓冲液（PBS）漂洗3次；④1%锇酸固定3 h；⑤PBS漂洗3次；⑥脱水；⑦浸透：用二甲基酮与Epon812包埋剂混合液（1∶2）浸透；⑧包埋：将样品移到Epon812包埋剂中进行包埋；⑨超薄切片：用UltracutE超薄切片机进行超薄切片，厚度为50～100 nm，干燥后即可染色；⑩染色：醋酸双氧铀染色15 min，蒸馏水彻底水洗3次；枸橼酸铅染色15 min，再用蒸馏水彻底水洗3次。切片干燥后即可置于 电子 显微镜（日本JEOL公司JEM1200EX透射电镜）下观察。 　　1.2.4 原位末端标记凋亡细胞末端转移酶标记技术（Tunel法）检测 　　严格按照试剂盒说明书操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片随机选择5个视野（×400），记录阳性染色的心肌细胞数及心肌细胞总数，以凋亡细胞数占心肌细胞总数的百分比来确定凋亡指数（AI）。AI=Tunel阳性细胞数/心肌细胞总数×100%。 　　1.2.5 心肌细胞中bcl2、bax蛋白表达的免疫组化（SP）法检测 　　将取材中10%中性甲醛固定的标本固定24 h后行常规石蜡包埋、切片，厚度约4.5 μm，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。①二甲苯和酒精脱蜡；②3%过氧化氢孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性，PBS液冲洗；③5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min；④加入一抗：bcl2、bax均为1∶100稀释后加入玻片中，4℃过夜，PBS液洗3次，每次5 min；⑤加入二抗：滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。⑥显色：加入二氨基联苯胺（DAB）显色剂5～10 min；⑦HE复染2 min，脱水、透明、封片、镜检。每张切片随机选取5个视野(×400)采用VIDAS图像分析系统（德国欧波同公司）测定其阳性表达面积、平均光密度和积分光密度，并采用公式：单位面积平均光密度=〔积分光密度/(512×512)〕×100% 进行数据换算。 　　1.3 统计学