苏木乙醇提取物对坐骨神经损伤小鼠免疫功能的影响.docVIP

　　苏木乙醇提取物对坐骨神经损伤小鼠免疫功能的影响 作者：张辉 曹剑 刘飙 尹维田 【摘要】 目的 研究苏木乙醇提取物（SME）对坐骨神经损伤小鼠免疫功能的影响。方法 选取成年雄性Balb/c小鼠60只，随机分为SME高中低剂量组和空白对照组，行右侧坐骨神经离断吻合术，分别于术后3、5、7、14、28 d以MTT法测定淋巴细胞增殖转化能力，ELISA法测定血清循环免疫复合物（CIC）浓度。结果 各时间点小鼠淋巴细胞增殖转化能力及血清CIC浓度与SME剂量呈明确的量效关系。结论 SME能够影响坐骨神经损伤小鼠的细胞及体液免疫功能，且与用药剂量存在明确量效关系。 【关键词】 苏木乙醇提取物；神经损伤；免疫 　　在以往对活血化瘀类中药进行的免疫活性筛选中，苏木显示出超众的免疫抑制效用〔1〕，有报道证实苏木乙醇提取物对大鼠淋巴细胞活性有显著抑制作用〔2〕。诸多相关研究显示周围神经损伤后，损伤局部发生的免疫反应对神经再生起抑制作用，免疫反应越强，神经纤维再生和功能恢复越差，抑制神经损伤触发的免疫反应对神经再生起促进作用〔3〕。本文拟通过对离体免疫细胞活性及血清循环免疫复合物（CIC）的测定，研究苏木乙醇提取物对坐骨神经损伤Balb/c小鼠免疫功能的影响，为苏木应用于促进周围神经再生寻找理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物与试剂 　　健康雄性Balb/c小鼠60只，体重18～22 g（吉林大学实验动物中心），随机分为苏木醇提物高、中、低(16、8、4 g·kg-1·d-1)剂量组及生理盐水对照组。各按术后3、5、7、14、28 d分为5个时间点，每个时间点12只。主要试剂：苏木乙醇提取物购自陕西昌岳植化技术公司，刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)、MTT粉购自Sigma公司，胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司，小鼠CIC酶联免疫分析试剂盒购自Rapidbio公司，RPMI1640购自Gibco公司。 　　1.2 模型制备与给药 　　1%硫喷妥钠100 mg/kg腹腔麻醉小鼠，术区常规消毒，做右侧臀部斜行切口，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经。在坐骨结节下0.5 cm处完全切断神经干，12倍手术显微镜下将断端对位后以90无损伤线吻合断端两针，逐层闭合创口。给药方法和剂量：采取灌胃方法给药。参照临床应用苏木原药剂量，等效换算为小鼠灌胃用剂量〔4〕，将此数值作为给药的中等剂量，并以等比数列量确定高低剂量组用量。连续给药14 d。 　　1.3 淋巴细胞增殖转化试验 　　预实验测定ConA最适终浓度为5 μg/ml，LPS最适终浓度为40 μg/ml。按时间点顺序，每组取小鼠3只，眼球取血约0.5 ml后断颈处死，无菌取脾，置入含RPMI1640的平皿中，研磨吹打均匀后，200目钢丝网过滤吸取细胞悬液。以RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×107/ml，加入微孔培养板，每孔0.1 ml。20%FBS（FBS∶RPMI1640=1∶4）调整ConA浓度为10 μg/ml，LPS浓度为80 μg/ml。每个样品各加3复孔，每孔加入ConA/LPS 0.1 ml，设对照3复孔，每孔加入20%FBS 0.1 ml。37℃ CO2孵育箱培养44 h，加入MTT（5 mg/ml）20 μl/孔，继续孵育4 h。小心吸去上清，加入DMSO原液100 μl/孔，震荡器震荡10 min。酶标仪上读出结果（OD570 nm）。结果判定，刺激指数SI=药物刺激孔OD均值/对照组OD均值。 　　1.4 ELISA法测定小鼠CIC 　　将1.3中所取血液于无菌EP管中常温静置2 h后4℃冰箱过夜，次日5 000 r/min离心3 min，取上层血清，储存于-20℃冰箱备用，待所有动物取材完毕后同时进行ELISA测定。方法严格遵照试剂盒说明书。 　　1.5 统计学方法 　　应用SPSS13.0软件进行组间t检验。 　　2 结果 　　2.1 各时间点小鼠T/B淋巴细胞增殖转化结果 　　除术后3 d低剂量组外，其余各时间点各剂量组与对照组间均存在显著差异(Plt;0.05,Plt;0.01,Plt;0.001)，且依剂量由低到高显著性呈递增趋势。见表1。表1 术后各时间点小鼠T/B淋巴细胞增殖转化结果(略) 　　2.2 各时间点小鼠CIC酶联免疫分析 　　血清CIC浓度在术后5～14 d呈现明显上升趋势，至术后28 d基本恢复如常。各时间点各剂量组与对照组之间的差异性与用药剂量存在明确的量效对应关系。见表2和图1。表2 各时间点小鼠CIC浓度对比结果(略) 　　3 讨论 　　上世纪80年代之前，由于血神经屏障的存在，神经一直被认为是免疫豁免区。然而随着研究的深入，发现了鼠坐骨神经损伤之后血液中出现的抗神经节苷脂抗体和髓鞘自身抗