过表达αsynuclein的细胞毒性及对损伤性刺激的影响.docVIP

　　过表达αsynuclein的细胞毒性及对损伤性刺激的影响 作者：金金 苑玉和 杨波 孙建栋 陈乃宏 【摘要】 目的 构建过表达αsynuclEin的细胞模型，研究过表达αsynuclEIn的细胞毒性作用及其分子机制，为揭示帕金森病（PD）可能的发病机制和寻找 治疗 药物潜在靶点提供依据。方法 脂质体法转染及过表达αsynuclein稳定株的构建，MTT法、PI染色、荧光显微镜观察用于检测过表达αsynuclein对细胞活性和分化、撤血清及MPP+损伤的影响，荧光素酶报告基因检测和PP+毒性对细胞的损伤程度。过表达αsynuclein能够明显加重MPP+对NFκB转录激活活性的抑制作用，其机制可能与抑制IκBα的磷酸化有关。 结论 基于遗传背景与环境因素相结合的PD研究模型能够更好地拟合其病理过程，更加 科学 合理。NFκB信号通路活性的抑制可能是PD发病的又一新机制，针对该通路上相关蛋白的深入研究可能成为PD治疗药物开发的新型研究方向。 【关键词】 帕金森病；αsynuclein；细胞毒性；MPP+；NFκB 　　流行病学调查显示帕金森病（PD）已成为当今世界上仅次于阿尔茨海默病的第二大中枢神经系统退行性疾病，但其病因及发病机制尚不清楚。αsynuclein是第一个被发现的PD相关基因，其突变体（A53T、A30P、E46K）被证实与家族性PD的发病密切相关。近年来人们发现位于αsynuclein基因启动子区的二核苷酸重复序列多态性能够上调该基因表达水平，并与PD的主要发病形式——散发性PD的发病密切相关〔1，2〕。由于多巴胺能神经元的大量丢失是导致PD各种临床表型的直接原因，本实验拟通过分别构建稳定株和瞬时表达模型来考察过表达αsynuclein对于多巴胺(DA)能细胞活性状态的影响，并进一步探讨其可能的分子机制，为深入揭示PD的发病机制提供新的视角，并为PD的治疗提供新的理论依据和潜在靶点。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞株、菌种和质粒 　　PC12（大鼠肾上腺嗜酪细胞瘤细胞）、HEK293T细胞购自 中国 医学科学院基础医学研究所细胞中心。菌株E.coli.DH5α为北京天为时代科技有限公司提供；质粒pEGFPN1购自Clontech公司；pEGFPαsynuclein为本实验室构建保存；pNFkBluc购自Strategene公司；pRLTK购自Promega公司。 　　1.1.2 试剂 　　细胞培养基购自Gibco公司；胎牛血清、马血清购自Hyclone公司；实验耗材购自Corning公司；G418、PI、MTT、MPP+购自Sigma公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；αsynuclein、NFκB、IκBα、pIκBα、βactin多抗均购自Santa Cruz公司；HRP标记的二抗为中杉金桥生物技术有限公司分装进口试剂；双荧光素酶检测试剂盒与BCA蛋白定量试剂盒购自威格拉斯生物有限公司；ECL发光检测试剂盒购自普利莱基因技术有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。 　　1.1.3 仪器 　　酶标仪（MDC SPECTRAMAX 190）；倒置荧光显微镜及照相系统（Olympus，IX70142）；激光共聚焦显微镜系统（Nikon DIGITAL ECLIPSE CLsi）；增强型化学发光检测系统（Molecular Device，Lmax REF）；ECL检测系统（Molecular Device，Lmax） 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 　　PC12细胞用含10%马血清、5%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于5% CO2培养箱内37℃进行培养，隔天换液。HEK293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液于5% CO2培养箱内37℃培养。 　　1.2.2 细胞转染及稳定株的构建 　　细胞以一定密度接种于培养板中，至约90%融合时，按照LipofectamineTM 2000说明书步骤进行转染，置于37℃、5% CO2孵箱中培养，并于24～48 h后换液。PC12稳定株转染48 h后加入终浓度为500 μg/ml的G418筛选，每3 d换液，待阳性细胞大量扩增后进行鉴定。 　　1.2.3 SO，置酶标仪上以490 nm波长检测各孔吸光度。 　　1.2.5 PI染色 　　细胞接种于confocal专用培养皿中，加入终浓度为50 ng/ml NGF进行诱导分化，每2 d换液。加入PI溶液使其终浓度达 10 μg/ml，混匀，37℃避光孵育15 min后，在激光共聚焦显微镜下观察。 　　1.2.6 双荧光素酶报告基因检测 　　HEK293T细胞接种于24孔