人Tum5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建.docVIP

　　人Tum5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建 作者：盖晓东 罗宏 历春 冯凯 【摘要】 目的 构建携带Tum5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系。方法 采用RTPCR法从胎肾组织中扩增Tum5基因片断，并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定。利用电穿孔方法将获得的重组质粒转染PA317细胞，经G418 筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3 细胞测定病毒滴度。结果 PCR、酶切证实Tum5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN，Tum5基因测序结果和原始序列相同。重组逆转录病毒载体转染PA317 包装细胞,RTPCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/ml。结论 成功的构建了携带人Tum5基因的逆转录病毒载体，获得了稳定的产毒细胞系。 【关键词】 Tum5基因；pLXSN；基因 治疗 ；抗血管生成；逆转录病毒载体 肿瘤的生长转移依赖于血管生成，抑制肿瘤血管的生成成为肿瘤治疗学研究的新热点。肿瘤抑素（tumstatin）是最新发现的肿瘤血管生成抑制因子,可有效抑制人内皮细胞的增生,引起内皮细胞凋亡,抑制新生血管的生成,达到抗肿瘤生长的目的〔1〕。Tum5是肿瘤抑素的抗血管生成活性片段，并与全长肿瘤抑素具有相同的抗血管活性〔2〕。其抗血管生成作用要比先前发现的血管内皮抑素（endostatin）强10倍,并呈剂量依赖关系〔3〕。本研究立足于抗血管生成的基因治疗原理，构建携带Tum5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,以获得稳定的产毒细胞系,使得Tum5用于肿瘤以及其他血管依赖性疾病的基因治疗成为可能。 1 材料与方法 1.1 材料 pLXSN 质粒由扬州大学馈赠，大肠杆菌菌株DH5α为北华大学生命 科学 中心保存，胎肾组织来自吉林市妇产 医院 ，Trizol和G418均购自GIBICO公司，RTPCR试剂盒、DNA纯化试剂盒、各种工具酶及Marker等均购自大连TaKaRa公司，PA317细胞购自中科院上海细胞研究所，NIH3T3细胞由东北师范大学生科院馈赠。DMEM培养基、新生牛血清购自长春市博德生物公司。其余试剂均为国产分析纯。电穿孔使用德国Eppendorf pany生产的Multiporator型细胞融合仪。Tum5引物序列由上海生工生物技术有限公司合成，P1：5′GGAATTCAATCAACGAGCCCACGGAC3′ （划线部分为EcoRⅠ酶切位点）；P2：5′CGGGATCCTTAGGCGATCGCAGGACCTCC3′（划线部分为BamHⅠ酶切位点）。 1.2 方法 1.2.1 RTPCR方法扩增目的基因片段 从液氮罐中取出冻存的胎肾组织块放入研钵中,少量多次加入液氮,研成极细粉末。将粉末移至离心管中,用Trizol 裂解液提取总RNA 。然后以2 μg 的总RNA 为模板，以Oligo(dt)15为引物进行反转录,制备cDNA。以TaqDNA聚合酶进行PCR 扩增，反应条件：94℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环。末次循环后再于72 ℃继续延伸10 min。将得到的基因片段进行琼脂糖电泳分析,最后用PCR纯化试剂盒纯化和回收所需要的目的基因片段。 1.2.2 重组体pLXSNTum5的构建与鉴定 将Tum5基因片段与已进行相应酶切(EcoRⅠ+ BamHⅠ)的pLXSN载体以1∶5摩尔比混合,加入T4 DNA 连接酶16℃过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,转化菌涂于含有氨苄青霉素的LB 平板上，设立阴性对照,于37℃培养14～16 h后筛选阳性克隆。挑取单菌落置于含有氨苄青霉素的LB中250 r/min,37℃过夜。按质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，对重组质粒以EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切、PCR及测序鉴定。取测序正确的重组质粒进行下一步研究,并命名为pLXSNTum5。 1.2.3 重组质粒转染PA317细胞及假病毒颗粒的收集 将处于对数生长期的PA317细胞传代，并用电转缓冲液将细胞制备成1×107个/ml的悬液，按每400 μl细胞悬液加入30 μg 重组质粒，在250 V、20.4 ms条件下电击。将细胞加入无血清、无双抗DMEM培养基，放入37℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后换为600 μg/m的G418培养基继续培养。2 5的病毒颗粒存在。 1.2.4 重组质粒病毒滴度的测定 选取经鉴定含有重组质粒的病毒上清液行病毒滴度测定，将对数生长期的NIH3T3细胞按100个/孔接种于24孔板，每孔加50