2015—2016学年人教版选修一多聚酶链式反应扩增DNA片段课件（23张）.ppt

目录 上页 下页 习题 参考书 返回 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定。 一、基础知识 参与的组分 在DNA复制中的左右 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 ① ② ③ ④ ⑤ 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 A T G C A T G C 5，端含磷酸基团 3，端含羟基 3，端 5，端 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 DNA聚合酶的特性 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。 3’ 5’ 5’ 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 1、 DNA 分子的热变性原理 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃） 复性（缓慢冷却） 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物与两条单链结合 在80~100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。 2、 Taq DNA聚合酶的应用 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 3、PCR 反应的条件 ①DNA模板； ②分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）； ③四种脱氧核苷酸； ④耐高温的聚合酶； ⑤控制温度，但不需解旋酶； ⑥需要在一定的缓冲液中进行。 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 1、PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个步骤──变性、复性和延伸。 循环之前的一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 950C变性 550C复性 720C延伸 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸 2、PCR的反应结果 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 二、 PCR 的实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 2、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 3、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 1、准备 2、移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。 注意： 3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。 将微量离心管放在离心机上,离心约10s 4、离心 5、反应 目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 三、操作提示 1．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3．在微量离心管中添加反应成分时，使用一次性枪头。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。 目录 上页 下页 习题 参考书 返回 （一）理论上DNA扩增数目的计算 四、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实