核酸分离纯.pptVIP

2.变性缓冲液 使细胞结构破坏，释放RNA。 4 mol/L 异硫氰酸胍 25 mmol/L 柠檬酸钠 0.85%　十二烷基肌氨酸钠 0.1 mol/L β－巯基乙醇 10%十二烷基肌氨酸钠 3. 2 mol/L NaAc（pH4.0） 为沉淀RNA提供Na＋。 4.水饱和酚液（pH4.0） 抽提RNA。 * 操作方法 组织细胞的匀浆、变性 离心收集培养的细胞，用PBS缓冲液洗涤，4 000r/min离心10分钟，去除PBS缓冲液，重复3次，加入变性液振荡至细胞裂解，液体变黏稠。 * RNA抽提 在上述裂解液中，加入1/10倍体积的2mol/L NaAc、等体积的水饱和酚、1/5体积的氯仿∶异戊醇（49∶1）（每加一种试剂后均应充分振荡混匀），置冰浴15分钟，4℃、12 000r/min离心20分钟，小心吸出上清，注意不要吸出富含蛋白质和DNA的中间界面。再加等体积的酚及1/5体积的氯仿∶异戊醇（49∶1），颠倒混匀，4℃、12 000r/min离心20分钟，小心吸取上清。 * 沉淀RNA 　 加入等体积的异丙醇，－20℃沉淀1～2h。4℃、12 000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用0.3ml变性液，重新混悬至沉淀完全溶解。加等体积异丙醇，混匀，－20℃1～2h，4℃、12 000r/min离心20分钟，弃上清，用预冷的75％酒精洗涤沉淀1～2次，将沉淀于室温晾干，溶于无RNA酶的水中。 * 原理 与蛋白质分子类似，DNA分子也是两性电离分子。在pH8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动。但不同大小和构象的DNA分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，迁移率区别很小，难以分开。采用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持介质，发挥其分子筛效应，则可使分子大小和构象不同的DNA分子迁移率出现较大差异，从而达到分离目的。 琼脂糖凝胶电泳 * 电泳后经溴化乙锭染色，在紫外光照射下DNA显橙红色荧光，可直接观察判断结果或照像。 DNA在凝胶中的迁移率与它的分子量的对数成反比，若将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离相比较，可以计算出未知DNA片段的大小。 * * 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 2.0 0.1～2 * 仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等 仪器和试剂 * Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） 常用电泳缓冲液 * 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 上样缓冲液 * 溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng，EB的使用的终浓度为0.5ug/ml。 核酸染色剂 注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 * DNA分子量标准 * 不同种类DNA Marker * 1.凝胶制备 制备1%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃ 时，加入 EB 至终浓度 0.5μg/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取10μl DNA样液与 2μl 上样 buffer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。 4.观察拍照 四、操作步骤 * * * * * ②压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。 常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。 如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。 ③超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手 段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超声 空穴局部过热引起的生物大分子的变性，所以超声振 荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处 理，尽量减小热效应引起的酶的失活。 * ３.化学破碎法 通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方