生物工程下游技术53双水相萃取NEW-2006.ppt

概述 双水相萃取（Two-aqueous phase extraction）又称水溶液两相分配技术（Partion of two aqueous phase system）是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。 其特点是能够保留产物的活性，操作可连续化，能耗低，处理容量大。 双水相萃取现象最早是1896年由Beijerinck在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的，被称为“聚合物的不相溶性”。 1989年Diamond等推导出生物分子在双水相体系中的分配模型，但尚有局限。 双水相体系的形成 典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（DEX），各溶质均为低浓度时，可得到单相匀质液体；当溶质浓度增加时，溶液变得浑浊，静止形成双液层：上层富集PEG，下层富集葡聚糖。 葡聚糖本质上是一种几乎不能形成偶极现象的球形分子，而PEG是一种具有共享电子对的高密度直链聚合物。各个聚合物分子都倾向于在其周围有相同形状、大小和极性的分子，同时，由于不同类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引力，因此聚合物发生分离，形成二个不同的相，这就是所谓的“聚合物不相溶性”。 双水相系统的重要特征 两相的黏度：萃取相在2~10mPa.s范围内，而发酵液匀浆相在100~10000mPa.s范围内。 双水相系统呈现出低的界面张力。 双水相体系的类型 双水相萃取的理论基础 表面自由能的影响 生物大分子在两相中的分配仍服从分配定律。 根据相平衡时化学位相等原则，可求得K： 表面电荷的影响 由此可见，电位差的变化也会对分配系数产生影响。 综合以上两种因素，分配系数可用Gerson提出的公式表示： 由此可见，分配系数和表面自由能及电位差成指数关系。 双水相系统中物质分配的影响因素 双水相中聚合物组成的影响 当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存在三种情况： 完全混溶性（匀相溶液）； 物理的不相溶性（相分离）； 复杂的凝聚（相分离）。 eg. 离子和非离子型聚合物都可使用在双水相系统的构成上，但当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们相互吸引并发生复杂的凝聚。 由表2、表3可见，蛋白质的分配系数随着葡聚糖相对分子量的增加而增加，随着PEG相对分子量的增加而降低。 葡聚糖也可由其他多糖代替，可得到类似的结果，如右图所示。但发生相分离时的浓度要高些。 双水相系统物理化学性质的影响 双水相系统的性质主要取决于下列物理参数：密度（ρ）和两相间密度差、黏度（μ）和两相间黏度差、表面张力（σ）。 eg. PEG-(NH4)2SO4双水相系统萃取糖化酶 (NH4)2SO4浓度固定不变时，增加PEG400的浓度有利于酶在上相的分配，当PEG400浓度在25~27%时，分配系数高达47.3，浓度过高则不利于酶的分配。 PEG400浓度固定为26%时，增加(NH4)2SO4浓度，糖化酶的分配系数也增大。 (NH4)2SO4的最适浓度为16%。 盐和缓冲液的影响 水溶液中存在的离子会影响溶质在两相间的分配。因为阴阳离子的不均匀分配会产生相界面电位，影响蛋白质、核酸等荷电大分子的分配。通常增加盐浓度可提高酶的分配系数。 eg. 在PEG-DEX系统中加入NaClO4或KI，能增加上相对带正电物质的亲和效应，并迫使带负电物质进入下相；若加入Li3PO4，则与上述效应刚好相反。 因此，只要设法改变界面电位，就能控制蛋白质等荷电大分子转入某一相。 温度的影响 温度的变化虽然影响液相物理性质的变化，从而影响溶质在两相间的分配，但总的来说，影响不敏感。 双水相系统的应用 酶的提取和纯化 核酸的分离及纯化 细胞组织的分离 用三甲胺PEG/ Dextran 体系可分离含胆碱受体的细胞 病毒的纯化： 用PEG/ NaDS 体系可对脊髓病毒和线病毒进行纯化,回收率可达90 % 生长激素的纯化：用PEG/ 盐体系可提纯人的生长激素,回收率Y= 60% 干扰素的分离： 用PEG- 磷酸酯/ 盐体系分离β- 干扰素, Y= 97 %; 从重组大肠杆菌匀浆中提取α- 干扰素, Y= 99.15 % ,纯度提高25 倍 生物小分子物质的分离： 双水相体系萃取分离技术对青霉素G钠盐等生物小分子物质的分离也可以取得理想效果 药物的分离和提纯： 如基因工程药物