应用蛋白质组学技术研究HL60细胞及其耐阿霉素细胞株的蛋白表达差异.docVIP

　　应用蛋白质组学技术研究HL60细胞及其耐阿霉素细胞株的蛋白表达差异 作者：胡建达 林敏辉 陈鑫基 刘庭波 魏天南 李静 吕联煌 【摘要】 目的 比较人髓系白血病细胞株HL60细胞和耐阿霉素的细胞（HL60/ADR）的整体蛋白表达谱，以期获得人髓系白血病细胞的耐药相关蛋白。 方法 提取HL60细胞和HL60/ADR细胞的总蛋白，采用荧光差异显示的双向凝胶电泳技术（DIGE）比较分析差异表达蛋白；经胶内酶解，MALDITOF/TOF质谱分析，搜索蛋白质数据库，获得差异蛋白质的信息。 结果 经过初步筛选和质谱分析共获得16个具有统计学意义的表达差异蛋白点，其中13个在HL60细胞中表达上调，3个表达下调。主要是代谢酶类、DNA修复、信号转导相关蛋白、细胞周期调节蛋白和细胞增殖与凋亡等相关的蛋白。 结论 根据人髓系白血病细胞株HL60细胞和HL60/ADR细胞的差异蛋白表达谱比较，筛选出耐药相关蛋白。 【关键词】 HL60白血病细胞； 白血病； 电泳，凝胶，双向； 蛋白质组学； 多药耐药相关蛋白质类 白血病是一组异质性造血系统恶性肿瘤，目前的 治疗 方法仍以化疗为主，近年来白血病的治疗已经取得了较大的进展，但是对化疗药物产生耐药依然是大多数白血病治疗失败的主要原因。多药耐药（multidrug resistance，MDR）是耐药的主要机制之一，但可能仍存在其它耐药相关机制尚未被了解[12]。为了更好地了解在耐药发生过程中蛋白质所发挥的作用，笔者应用人髓系白血病细胞株HL60细胞和耐阿霉素的HL60细胞（HL60/ADR）作为模型，采用蛋白质组学研究技术——荧光差异显示的双向凝胶电泳（tensional difference in gel electrophoresis,2D DIGE）比较两者间表达蛋白的差异，旨在从蛋白质整体水平对细胞耐药现象发生后产生的相关蛋白变化进行研究，探讨耐药产生的机制，为进一步寻找逆转耐药的新靶点奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂和仪器 考马斯亮兰R350（瑞典AMERSHAM），十二烷基磺酸钠(SDS)、甘氨酸、丙烯酰胺、TEMED（美国BioRad）。Ettan IPGphor 等电聚焦系统（瑞典AMERSHAM），Hofer SE 600（瑞典AMERSHAM），扫描仪（GS 710，美国BioRad）。 1.1.2 细胞株 人髓系白血病细胞株HL60细胞和HL60/ADR细胞引自 中国 医学 科学 院天津血液病研究所。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 2株细胞分别在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养。 1.2.2 样品的制备和定量 收集生长良好、对数生长期的HL60细胞和HL60/ADR细胞各1×107，离心（1 000 r/min，5 min ），弃上清，加入适量的PBS洗涤，再离心（1 000 r/min，5 min ），重复3次，获得洗涤后的细胞。每管加入200 μL DIGE 裂解缓冲液[7 mol/L Urea，2 mol/L 硫脲，4% CHAPS，0.2%固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)缓冲液，罗氏混合酶抑制剂]，冰浴超声破碎（80 ALDITOF/TOF质谱，软件分析数据，鉴定蛋白质。 1.3 统计学处理 蛋白质表达谱的差异用Student′s t 检验。 2 结 果 2.1 DIGE凝胶图谱 通过双向凝胶电泳，在HL60细胞和HL60/ADR细胞的差异表达蛋白DIGE凝胶图谱中可见所表达的蛋白点数多，分布均匀且清晰，经过DIGE标记，筛选出在HL60细胞和HL60/ADR细胞之间表达差异的蛋白点，可以用于下一步的质谱分析（图1）。 2.2 MALDITOF/TOF质谱鉴定 切下HL60 绿色框内为差异蛋白点的位置;黄色框内为差异蛋白点的编号. 细胞和HL60/ADR细胞的差异蛋白点进行酶解，采用质谱分析技术MALDITOF/TOF鉴定，差异蛋白点的性质见表1。表1 经MALDITOF/TOF质谱鉴定的差异表达蛋白 2.3 差异表达蛋白质的归类 经过初步筛选和质谱分析共得到18个表达差异的蛋白点，其中有2个差异蛋白点经鉴定属于同一种蛋白质（蛋白点940和955同为mutant betaactin，蛋白点1 536和1 538同为nucleolar phosphoprotEin B23），因此，通过比较HL60细胞和HL60/ADR细胞的差异蛋白表达，最终得到16个具有统计学意义的表达差异蛋白点（均Plt;0.001）