印迹杂交.ppt

分子杂交 分子杂交：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA单链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。 分子杂交广泛用于测定基因拷贝数、基因定位、确定生物的遗传进化关系。通常对天然或人工合成的DNA或RNA片段进行放射性同位素或荧光标记，做成探针，经杂交后，检测放射性同位素或荧光物质的位置，寻找与探针有互补关系的DNA或RNA。 印迹技术 印迹技术是指将待测核酸分子结合到一定固相支持物上的方法。 Southern印迹:将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。 Northern印迹:将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 Western印迹：将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品转移至到固相载体上的过程。 Southern印迹 Southern印迹杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。　　 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。 Southern 凝胶转移杂交技术步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹) 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测 Southern杂交 （一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 （二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶，分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小 相同的分子处于同一条带 （三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 （四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程 Southern杂交 （五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点，预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交，双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA （六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针 主要应用 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 Northern印迹 Northern印迹杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。Northern印迹杂交常用于检测组织或细胞的基因表达水平。 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性;不能用碱变性，防止水解。用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛变性。　　 3、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 4、靶核酸为RNA 5、探针可用DNA或RNA片段　 Northern印迹 主要应用 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。 Western印迹 Western印迹，也称Western免疫印迹（WesternBlot或WesternBlotting），是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体上，然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。 原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 Western 印迹 主要步骤： 蛋白质样品