简论牛IgG2Fc受体(boFcγ2R)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达.docVIP

　　简论牛IgG2Fc受体(boFcγ2R)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达 【摘要】 　　目的: 构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21(DE3)中表达。方法: 提取健康成年牛的白细胞总RNA, 经RTPCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段, 并将其克隆到载体pGEMT Easy, 经限制性内切酶EcoRI和 NotI双酶切鉴定及序列测定后, 再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中, 构建重组质粒pET2R, 转化E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果: 获得682 bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段。以构建的重组质粒pET2R转化E.coli BL21(DE3)后, 经IPTG诱导, 表达出相对分子质量(Mr)约为30000的重组蛋白。SDSPAGE分析显示, 表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21(DE3)的胞质中, orton等[6]证明boFcγ2R的EC1区是亲和IgG2Fc的特异结构功能区, 2006年Zhang等[7]又将boFcγ2R的线性配体结合表位精确定位于EC1区FG loop的4肽区域。这些发现对于探索反刍动物免疫调节的分子机制, 及开发新药和新药靶的研究提供新的思路。为了进一步研究这一新型受体和IgG的相互作用机制及其介导的免疫反应, 我们用RTPCR技术扩增了boFcγ2R的胞外环区并在大肠杆菌中进行了表达。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 pGEMT Easy Vector SystemⅠ、 EZ spin column total RNA isolation kit、 限制酶EcoR I和Not I、 T4 DNA连接酶购自promega公司; pET28a Vector、 E.coli JM109和E.coli BL21(DE3)均购自宝生物工程（大连）有限公司; AEC(3Amino9ethylcarbazole)显色试剂盒为华美生物公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计 参照张改平发表的牛Fcγ2R的基因（Z37506）核苷酸序列利用引物设计软件Primer 5.0设计了一对引物: 上游引物B11: 5′CCGGGAATTCAGTGTGGGCCTAAGGA3′, 下游引物B12: 5′TTTAGCGGCCGCCCGGATGAGATTCTGC3′, 由大连宝生物生物工程公司合成。为便于基因的克隆及构建表达载体等后续工作, 在引物中引入EcoR I、 Not I酶切位点。 　　1.2.2 总RNA的提取和RTPCR 从新鲜抗凝牛血中分离牛白细胞, 用EZ spin column total RNA isolation kit提取总RNA, 以B11、 B12为引物, 按照RTPCR试剂盒操作手册对boFcγ2R基因进行RTPCR扩增, 反应体系如下: RNaseFree V/Tf1 5× Reaction Buffer 10 μL, dNTP Mix (10 mmoldNTP) 1 μL, Dostream primer 1 μL（50 pmol）, Upstream primer 1 μL（50 pmol）, 25 mmol/L MgSO4 2 μL, AMV Reverse Transcriptase 1 μL, Tf1 DNA Polymerase 1 μL, RNA sample 10 μL, Final volume 50 μL。第1链cDNA合成参数为48℃反转录45 min。第2链合成时先在94℃预变性2 min, 同时灭活AMV反转录酶; 然后进入以下40个循环: 以94℃变性0.5 min, 60℃退火1 min, 68℃延伸2 min; 循环完毕后68℃继续延伸10 min。将RTPCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 并回收目的片段。 　　1.2.3 目的基因的克隆与测序 将回收、 纯化的目的基因片段与pGEMT Easy载体于16℃连接过夜, 次日转化到JM109感受态细胞中, 提取质粒酶切鉴定和序列测定。 　　1.2.4 重组表达载体的构建和鉴定 将克隆到T载体上的阳性质粒经EcoR I和Not I双酶切, 获得的目的片段插入表达载体pET28a相应酶切位点, 重组pET28a转化表达菌BL21（DE3）, 挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定, 并命名为pET2R。 　　1.2.5 重组蛋白的表达 将阳性重组质粒转化BL21(DE3)表达宿主菌中, 挑取单菌落, 接种到5 mL LB（含50 mg/L卡那霉素）培养液中37℃振荡过夜培养, 次日以1%的接种量转入5 mL的LB培养液（含50 mg/L卡那霉素