黑籽重楼种内形态标记和ISSR标记的遗传分化研究.docVIP

　　黑籽重楼种内形态标记和ISSR标记的遗传分化研究 作者：陈照， 叶睿超， 张瑞， 李伟阳， 王丽 【摘要】 　　该文对黑籽重楼Paris thibetica种内两变种——黑籽重楼原变种Paris thibetica var. thibetica与无瓣黑籽重楼Paris thibetica var. apetala在形态学及ISSR分子标记上的差异进行了研究和比较。形态特征分析表明黑籽重楼原变种与无瓣黑籽重楼在萼片长宽、花药数、花丝长等7个花器官性状方面有显著差异，但通过在主成分分析图上不能明显区分两个变种，两变种总体形态上的分化不明显。ISSR分析上，从100个ISSR引物中筛选出8个引物，在300～1500 bp间共 扩增出 36条带，其中黑籽重楼原变种特征带有5条，无瓣黑籽重楼扩特征带有8条。 【关键词】 黑籽重楼 变种 形态差异 ISSR 　　Abstract:The morphological differentiation analysis on Paris thibetica var. thibetica and Paris thibetica var. apetala orphological differentiation beters 100 ISSR primers. And 36 bands plified by ISSR-PCR, of ple Sequence Repeat，ISSR)是一种基于微卫星序列发展起来的分子标记［7］, 具有简便、多态性高, 稳定性和重复性好等优点，在分类学、种系发生学、保护生物学和种群遗传学等方面得到迅速应用［6］。 　　本实验通过形态差异分析结合数量统计方法对不同生境下黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼的14项形态特征进行测定和分析，观察黑籽重楼的种内形态分化的水平，以达到了解其遗传多样性水平的目的。并采用ISSR分子标记技术对同域生长的黑籽重楼种下的黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼进行分子水平的遗传分化的研究，寻找区别两变种的特征带。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料用于形态分析的黑籽重楼共来自于10个居群，其中黑籽重楼原变种（Paris thibetica var. thibetica）分别来自于不同的7个居群，无瓣黑籽重楼(Paris thibetica var. apetala)分别来自于不同的3个居群（见表1）。表1 形态分析材料（略） 　　用于ISSR分析的黑籽重楼原变种（Paris thibetica var. thibetica）和无瓣黑籽重楼(Paris thibetica var. apetala)均采集于四川彭州龙门山（海拔2 560 m），各变种各取3株，叶片均用硅胶干燥。凭证标本藏于四川大学生命 科学 学院植物标本室。 　　1.2 方法 　　1.2.1 形态指标测量及相关数据分析选取10个居群的黑籽重楼的14个形态学指标进行测定。用SPSS 13. 0软件 计算 各形态学指标的平均值（X）、标准差（δ）、单因素方差分析、使用NTSYS-PC2.10进行主成分分析［8］。 　　1.2.2 基因组DNA提取基因组DNA提取采用CTAB法［9］，提取的黑籽重楼原变种和无瓣黑籽重楼基因组DNA分别为各变种的3个个体的混合样。通过1%的琼脂糖电泳检测DNA质量，-20℃保存备用。 　　1.2.3 ISSR-PCR扩增ISSR-PCR扩增体系为20 μl的PCR反应液。其中包括:10×buffer 2.5 μl，Mg2+ 2 μl (2mmol/L)，dNTP 2 μl( 0.12 mmol/L)，ISSR 引物2 μl (1 μmol)，Taq 酶0.5 μl( 1.5 U)，模板 2 μl( 50～100 ng)，超纯水9.5 μl。Taq酶，dNTP 和均购自Takara公司，ISSR引物序列由从加拿大哥伦比亚大学（UBC）提供。 　　PCR反应程序为94 ℃5 min，1个循环；94 ℃30 s，36 ℃60 s，72 ℃90 s，40 个循环；最后72 ℃延伸5 min。扩增产物以Takara公司100 bp DNAladder为分子标记，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结束后用EB染色，并用GeneGenius BioImaging System凝胶成像仪上成像观察。 　　 2 结果与分析 　　2.1 居群间形态变异对于来自于10个居群的黑籽重楼（黑籽重楼原变种7个居群，无瓣黑籽重楼3个居群）的14项形态特征进行统计分析（见表2），7个黑籽重楼原变种在居群间水平上，在除了叶片长、萼片宽的12个性状的差异极显著。3个无瓣黑籽重楼在居群间水平上，叶柄长、花药数、花丝长、花药长、萼片数5个形状的差异显著。表2 居群