细胞工程之核移植技术与动物克隆.pptVIP

核受体细胞选择： 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。 选择的生物学依据(或为何选择卵细胞为核移植受体细胞)： (1) 核受体细胞的准备 20 在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使 移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列。 使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点， 同受精卵一样开始个体发育过程。 卵母细胞的来源： 用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内 成熟的 MII 卵母细胞。 从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞 复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。 冷冻保存的卵母细胞 (1) 核受体细胞的准备 21 卵母细胞的去核处理： (1) 核受体细胞的准备 22 将MII卵母细胞置于含细胞松弛素(5-7.5ug/mL)的 培养液处理10-20min. 显微镜下以持卵管吸住卵母细胞. 以尖端去核针刺穿透明带，吸出第一极体和极体下 1/3胞质. 供体细胞核具备的条件： 必须是完整的二倍体，保持有供体动物完整的 基因组 供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生 细胞分化过程的逆转，能重新完成从受精到发育成 一个正常动物个体的全过程。 (2) 核供体细胞的准备 23 供体细胞类型： 胚胎卵裂球细胞 体细胞 胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞 (2) 核供体细胞的准备 24 (3) 细胞核移植 胞质内注射 透明带下注射 25 胞质内注射是用一个外径5～8μm 的注核针 吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内 把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的 卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合 固定针对准极体部位，将卵母细胞固定，去核微吸管对准极体插入透明带，将极体和部分细胞质吸入吸管中 26 吸管拉出时，细胞膜被拉长形成一个桥，吸管脱离透明带， 质膜被掐断，挤推出管中的极体和细胞质 27 体外受精卵形成的8细胞牛胚胎经透明质酸处理后，分离出8枚分裂球，吸取细胞核 28 将胚胎细胞的细胞核移入去核卵母细胞的透明带中 29 (4) 激活 受精引起的卵母细胞激活 人工的激活 激活是胚胎发育所必需的 人工激活: 30 是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞 从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态 瞬时直流电脉冲激活 化学试剂激活：Ca2+载体、乙醇、SrCl2、放线菌酮、 离子霉素 人工激活的手段: (5) 重组胚的体内或体外培养 核移植胚的体内培养： 一般植入输卵管4-7d，发育到桑椹胚或囊胚， 如牛、羊、猪 核移植胚的体外培养： 体外培养基培养，发育到桑椹胚或囊胚， 如大鼠、小鼠、兔 31 (6) 胚胎移植 受体母畜的选择： 皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、 体格稍大的当地品种 移植部位： 输卵管、子宫角 移植方法： 同期发情处理 常规法移植 32 第2节 核移植技术的应用 33 二、 核移植技术的应用 1．制备转基因克隆动物，?进行生物药物生产 2．培育优良畜种，扩大良种种群 3．开展异种动物克隆，拯救濒危动物 转基因克隆山羊生产：抗凝血因子III 转基因克隆羊、牛生产：a-1-抗胰蛋白酶 转基因克隆牛生产：胶原蛋白 转基因克隆猪生产：人生长激素 培育品系更纯的实验动物 培养优质畜种 培育种间杂交动物，用于育种 用兔卵母细胞获得大熊猫早期胚胎 34 二、 核移植技术的应用 4．与干细胞技术结合，开展治疗性克隆 治疗性克隆*** (Therapeutic cloning) 利用核移植技术与转基因和胚胎干细胞等生物技术结合， 体外培养所需细胞、组织器官、以替代或修补患者损伤 或患病的细胞、组织、器官的过程 运用举例： 患者体细胞 去核人卵母细胞 重组胚 囊胚 ES细胞 定向分化 多巴胺神经元 帕金森病 胰岛细胞 糖尿病 肝细胞 肝纤维化 CD4+T细胞 艾滋病 35 二、 核移植技术的应用 5．利用核移植技术，研究生物学的基本问题 细胞分化 基因调控 核质关系 基因组印记 36 克隆技术存在的问题 理论问题 分化的体细胞克隆对遗传物质重编程的机理还不清楚 细胞核内关闭的基因如何重启表达 细胞如何重新恢复全能性及过程 克隆动物的连续后代是否会累积突变基因 克隆动物是否会记住供体细胞的年龄 克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题不清楚 37 实践问题 克隆动物的成功率还很低 生出的部分个体表现出生理