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重组人表皮生长因子滴眼液（酵母） Recombinant Human Epidermal Growth Factor Eye Drops（Yeast） 本品系由高效表达人表皮生长因子基因的酵母，经发酵、分离和高度纯化后制成的滴眼液。含适宜稳定剂。 1 基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程菌菌种 2.1.1 名称及来源 重组人表皮生长因子工程菌株系由带有人工合成人表皮生长因子基因的重组质粒转化的酵母菌菌株。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。 2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1 划种BMG1琼脂平板 应呈典型酵母菌菌落形态，无其他杂菌生长。 2.1.3.2 染色镜检 在光学显微镜下观察，应形状规则，用次甲兰染色，无死亡细胞。 2.1.3.3 筛选标志检查 应符合该基因表型特征。 2.1.3.4 人表皮生长因子表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.5 人表皮生长因子基因稳定性检查 涂BMG1琼脂平板，挑选至少50个克隆，用聚合酶链反应检测人表皮生长因子基因，阳性率应不低于95％。 2.2 原液 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基中培养，供发酵罐接种用。 2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含任何抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适宜种子液。 2.2.3.2 在适宜温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、PH值、溶氧、补料、发酵时间等。 2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集处理菌体。 2.2.5 纯化 采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，即为人表皮生长因子原液。加入稳定剂，除菌过滤后于适宜温度保存，并规定其有效期。 2.2.6 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 2.3.1配制与除菌 2.3.1.1 稀释液配制 按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。 2.3.1.2 稀释与除菌 将检定合格的人表皮生长因子原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。除菌过滤后即为半成品，保存与2～8℃。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.4.3 规格 应为经批准的规格。 2.4.4 包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定（附录Ⅹ H）。 3.1.2 蛋白质含量 依法测定，（附录Ⅵ B第二法）。 3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg 蛋白质应不低于5.0×105IU。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法 依法测定（附录Ⅳ C）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为15.0％，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0％。 3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定（附录Ⅲ B）。色谱柱采用丁基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、以B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取0.5ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（22～37%B相），上样量不低于5μg，于波长220nm处检测，以人表皮生长因子色谱峰计算理论板数应不低于500。按面积归一化法计算，人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0％。　 3.1.5 分子量 依法测定（附录Ⅳ C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为15.0％，加样量应不低于1.0μg，分子质量应为5.9kD+0.59kD。 3.1.6 外源性DNA残留量 每1次人用剂量应不高于10ng（附录Ⅸ B） 3.1.7 宿主菌蛋白残留量 应不高于总蛋白质的0.1%（附录Ⅸ E）。 3.1.8 甲醇含量 甲醇含量应不高于0.002％（附录Ⅲ C）。 3.1.9 等电点 主区带应为4.0～5.0（附录Ⅳ D）。 3.1.10 紫外光谱扫描 最大吸收峰波长应为277±3nm（附录Ⅱ A）。 3.1.11 肽图（至少每半年测定一次） 依法测定（附录Ⅷ E）,应与对照品图形一致。 3.1.12 N