彗星、western-blot技术.pptVIP

彗星实验与western-blot技术 刘静 温州医学院 单细胞凝胶电泳 掌握彗星电泳的原理 熟悉彗星电泳的操作方法 掌握彗星电泳的评价方法 单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出，后又经Singh N P和Olive P I进一步完善的一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法; 因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。它是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术; 此方法具有灵敏、快速的优点，同时既可以定性也可以定量，在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用价值。 培养细胞：γ射线照射细胞后，分别于照射后0h，30’，1h，2h，4h收集细胞并做细胞计数，以适量PBS重悬细胞； 血液细胞： 在2000 rpm （367g） 转速下离心 2min ,移走上清液，沉淀的血细胞用PBS（PBS:DMSO=9:1）悬浮后冷冻保存； 组织细胞：剪刀剪碎，搅动，组织碎片4℃沉淀15min。将上清液用250 μm的网过滤，再用7 μm的过滤器过滤，形成一个大小尺寸一致的细胞群 ； 用PBS调整细胞浓度为106个细胞/ml，取90 μl细胞悬液用10μl的苔盼蓝染色5min。光镜观察100