浅谈肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达与血清转氨酶水平关系.docVIP

浅谈肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达与血清转氨酶水平关系 【摘要】 　　目的: 探讨肝硬化患者外周血IP10、 IP10 mRNA的表达及其与转氨酶水平的关系。方法: 筛选典型HBV感染后肝硬化患者, 以ELISA法检测患者血清IP10水平; Realtime PCR检测IP10 mRNA含量, 以lg cDNA/lg GAPDH代表其mRNA水平。结果: 肝硬化患者血清IP10及PBMC中IP10 mRNA水平分别为(299.3±77.2) ng/L、 0.7479±0.1495, 与对照组相比差异有统计学意义(P0.05, P0.01); ALT、 AST升高组外周血IP10及其mRNA升高, 与转氨酶正常组相比差异有统计学意义(P0.05, P0.01)。升高组中 IP10与ALT、 AST及ALT/AST比值存在相关(r=0.6284, 0.7162, 0.6970, P0.01)。结论: 肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达增高, 与肝细胞损伤程度密切相关, 在介导肝炎后肝硬化进展中起重要作用。 【关键词】 肝硬化 IP 10 mRNA PCR 外周血 转氨酶 　　肝硬化是肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生, 是肝细胞在多因素作用下反复损伤的慢性病理过程。IFNγ诱生蛋白10(interferon γinducible protEin 10, IP10)是1985年Luster等用IFNγ刺激U937细胞株, 从cDNA基因库中筛选出, 属CXC家族ELR亚族, 可由IFNγ、 LPS等诱导产生, 介导Th1型炎症反应, 抑制血管新生及肿瘤生长。丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)与天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)及其AST/ALT比值能判断肝病进展及肝病预后的较好指标[1]。为了解IP10与血清转氨酶水平关系及其在肝硬化发病机制中的作用, 筛选39例慢性乙肝后肝硬化患者, 探讨其外周血IP10及其mRNA水平, 现将结果报道如下。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 FicollHypaque分离液购自上海试剂二厂; HBVDNA诊断试剂购自上海中亚基因研究所; ELISA法IP10试剂盒购自法国DLACLONE公司; TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司; cDNA合成试剂购自上海申能博采生物科技有限公司; 半自动生化仪ECOMF6124购自德国Eppendorf公司; EXL808全自动酶标仪和EXL50X全自动洗板机购自美国BioTek公司; LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green购自德国Roche公司; iCycle荧光实时定量PCR仪购自美国BioRad公司。 　　1.2 检测对象 39例肝硬化患者为2006-01/2007-05我校教学医院收治的患者。其中男27例, 女12例, 年龄31.2～62.5岁, 平均44.5岁, ALT升高者18例, AST升高者24例, AST/ALT1.0者27例; 入选患者均为HBV感染者, 临床诊断符合2005年全国病毒性肝炎会议修订诊断标准, 病程均超过6个月, 无合并HAV、 HCV、 HDV、 HEV、 HIV感染的实验室依据, 无其他自身免疫性疾病, 3个月内未系统使用抗病毒和免疫抑制剂治疗。另选25例本市中心血站体检正常献血员为对照组, 其中男16例, 女9例, 年龄20.3～42.9岁, 平均32.0岁。 　　1.3 方法 　　1.3.1 标本采集 分批采取患者晨起空腹静脉血5 mL, 分别置2支含肝素的无菌Eppendorf管和2支灭菌普通管。肝素抗凝血以FicollHypaque常规分离外周血单个核细胞(PBMC), 普通管常规分离血清备检。 　　1.3.2 血清IP10检测 采用ELISA以试剂盒提供标准品绘制标准曲线, 每批检测设空白、 阴性、 阳性对照各2孔, 取100 μL待测血清和100 μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗趋化因子单克隆抗体(mAb), 加至包被有趋化因子mAb的酶标反应板孔内, 37孵育1 h, PBS缓冲液洗涤5次, 加100 μL底物33甲基苯并噻唑啉6磺酸盐, 室温30 min, 加2 mol/L H2SO4终止反应, 在EXL808全自动酶标分析仪上(450±2) nm处读取A值, 每孔测定2次, 取均值, 依标准曲线确定血清IP10含量。IP10最低检测水平2 ng/L, 且批内和批间变异系数分别为5%和7%。 　　1.3.3 IP10 mRNA检测 采用Realtime PCR法。将分离的PBMC以RPMI1640培养液调整细