cDNA-AFLP好.ppt

cDNA-AFLP cDNA-AFLP 技术是一种结合了AFLP和RT-PCR优点的mRNA差异表达研究方法，就是将样本mRNA反转录并合成双链cDNA，用各含有4个碱基与6个碱基的两种限制性内切酶同时进行酶切，人工接头与其粘性末端连接后，用与接头互补的引物再进行预扩增，然后于引物的3′末再加上2至3个选择性碱基来进行选择性扩增，最后用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测扩增产物，看这些来源不同的mRNA 扩增产物的差异，以获得目的基因片段，最后对这些特异片段进行回收、测序及序列比对分析等。 优点 多态性丰富、重复性好、灵敏性高，对 RNA 的需要量较少、抗干扰力强、假阳性低，无需了解序列信息，可准确地反映基因间表达量的差异，对生物体转录组进行全面、系统的分析，成本比较低； 缺点 得到的TDFs（transcript-derived fragments） 片段长度过短，不利于进行下一步的研究；并不是所有的cDNA片段都同时具有试验中 所使用的两种限制性内切酶的识别位点，研究还不够全面；实验程序比较繁琐，特别是 银染显影技术操作复杂、耗时、灵敏度不高，而使用其它技术则不安全且费用昂贵 应用 cDNA-AFLP技术应用广泛，可进行特异表达基因分离及其表达特征研究，还有遗传标记和转录图谱构建，以应用于植物胚胎发育、形态发生、果实发育、信号传导、抗逆性、抗病性以及植物与真菌互作相关基因的比较鉴定与克隆。 Li等（2006）研究番茄白粉病，获得了887条TDFs。王升正（2001）利用cDNA-AFLP技术研究了棉花与黄萎病菌互作后根部的基因表达差异，获得了83条差异条带。Cooper等（2001）发现有12条与藜属植物的过敏反应有关的TDF。陈晓峰（2008）利用cDNA-AFLP技术从P. parasitica诱导的不结球白菜中得了一个新的几丁质酶基因。Eckeyt等（2004）研究大麦粉状霉菌，获得了120个差异表达的TDFs。Zheng等（2004）获得了12条与水稻抗条锈病有关的TDFs。Kemp等（2005）在木薯抗X.axonopodis pv.manihotis.菌的反应中发现了WRKY转录因子基因。李星等（2008）利用cDNA-AFLP技术研究了与小麦抗叶锈病LY41基因相关的差异表达基因。 cDNA一AFLP试验流程图 cDNA一AFLP指纹技术重复性高，“假阳性”低，可以检测低丰度表达mRNA。 DNA一AFLP技术可准确地反映基因间表达量的区别 全面获取转录组的表达信息 cDNA-AFLP实验流程 EcoR1酶切位点 G*AATTC C TTAA|*G EcoRI接头 5.一CTCGTAGACTGCGTACC一3. 3.一 CTGACGCATGGTTAA一5 Mse1酶切位点 T*TAA A AT*T MseI接头 5.一GACGATGAGTCCTGAG一3 3.一 TACTCAGGACTCAT-5. 双酶切 AATTC T G AAT TAA G T CTTAA 连接 新序列 CTCGTAGACTGCGTACCAATTC TTACTCAGGACTCAT CTGACGCATGGTTAAG AATGAGTCCTGAATAGCAG GACGATGAGTCCTGAG TAA GAATTGGTACGCAGCT TACTCAGGACTCAT T CTTAACCATGCGTCAGATGCTC 扩增 CTCGTAGACTGCGTACCAATTC TTACTCAGGACTCAT CTGACGCATGGTTAAG AATGAGTCCTGAATAGCAG GACGATGAGTCCTGAG TAA GAATTGGTACGCAGCT TACTCAGGACTCAT T