免疫细胞化学实验技能总结.pptVIP

缺 点：切片卷起呈圆筒状 原 因： 1．室温过低 2．石蜡过硬 3．刀口太钝 4．刀的倾角太大 补 救 办 法 ： 1．提高室温 2．加软蜡 3 用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3 片即成带 4．减小倾角 缺 点：切片粘附于切片刀，皱摺在一起 原 因： 1．室温过高 2．石蜡过软 3．刀口上留有一层石蜡 4．刀口钝 补 救 办 法 ： 1．降低室温 2．将蜡块投入凉水中稍浸 3．切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡 4．磨刀或移动刀口 缺 点：石蜡块将蜡带抬起 原 因： 1．由于摩擦而产生静电荷所致 2．石蜡块上面附有石蜡碎屑 3．刀口上附有石蜡碎屑 补 救 办 法 ： 1．提高室温 2．用刀片将碎屑清除 3．用二甲苯或氧仿清除 （2）冰冻切片的制作 取材 冰冻切片机切片　 冰冻胶固定 展片　 (一）优点： 　　1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。 　　2．快速，用时短。 　　3．组织变化不大。 　　4．能很好保存脂肪，类脂等成分。 　　5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。 　　（二）缺点： 　　1．不容易做连续切片。 　　2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 　　3．不容易制作较薄的切片。 　　4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。 石蜡切片和冰冻切片的比较 名称 石蜡切片 冰冻切片 操作步骤 繁琐 简单 抗原活性 可能会破坏组织的抗原性 完好地保存各种抗原活性及酶类 切片厚薄 薄 厚 优点 薄，观察结构清晰；连续切片 抗原活性好，适合免疫组化；简便操作 缺点 做免疫组化时部分需抗原修复 不能连续切片；不能较薄切片 细胞通透 脱蜡、复水 封闭　 抗原修复 封片、镜检　 二抗孵育 一抗孵育　 浸洗 浸洗 DAB显色　 （3）免疫酶法 脱蜡和复水：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。 抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。 常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。 细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。 血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温30min。但也要防止封闭过度。 一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳； 孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4度最佳，反应温和，但时间最好不超过16~24h。 切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。 注意：①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。②温柔浸洗，防止切片的脱落。③冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。④PBS的pH和离子强度的使用和要求。建议pH在7.4-7.6浓度为0.01M。（中性及弱碱性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解） DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。 DAB显色时间不是固定的