3-3章分子杂交与DNA测序.pptVIP

核酸分子(DNA or RNA)杂交： 把同源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。 或是指同一生物个体非同一分子来源但具有互补序列（或某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过碱基配对形成稳定的双链分子的过程。 核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe), 与变性后的单链基因组DNA或RNA等进行杂交。 用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。 特点： 灵敏度高（1pg互补序列） 速度快（24h） 简单易行 应用： 检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 酶切图谱制作 基因组中特定基因序列的定量和定性检测 基因突变分析，基因克隆的筛选， 疾病的诊断、微生物病原体检测 1. Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern杂交的用途： 进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组DNA的定性、定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析。 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 检测目的RNA（主要是mRNA）的存在与否及含量的方法。 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 Northern 杂交 原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。 应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。 方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗膜→压片→洗片→图像分析 3.Western印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。 4) 夹心杂交法(sandwich hybridization) 它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带标记的探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品. ii. 随机DNA引物标记法 ds-DNA→ss-DNA-(6n,t)→Klenow片段+dNTP(32P) 原理：用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。 iii. 反转录法 mRNA+dNTP(32P) →cDNA（标记） iv. 转录法 含有待标记DNA片段的重组质粒+NTP(32P)→→RNA（标记） SP6聚合酶 v. 引物延伸法 含待标记DNA的单链DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)→待标记DNA链 vi. T4 DNA聚合酶法 ds-DNA→T4 DNA聚合酶, 无dNTP→3’-5’外切酶活性→加入dNTP和标记核苷酸→新合成链（32P） 2) 末端标记 i. 5’-末端标记 ss-和ds-DNA, RNA→脱磷酸化反应 (CIP) → T4DNA激酶(γ-32P )ATP ii. 3’-末端标记