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核酸分子杂交技术第一节 核酸分子杂交的基本原理;一、DNA变性与复性;2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90-100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。 ;3、变性后核酸理化性质变化： 粘度降低； 密度增加； 紫外吸收值增加。;4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线 ;5、GC含量与Tm值之间的关系 Tm ：DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3 ;（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。;2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链； （2）局部双链周围碱基若不配对时，双链重新解离； （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列； （4）形成完整的双链分子。; 二、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度： （1）浓度越大，复性速度越快； （2）分子越大，复性速度越慢； （3）单链探针，浓度增加，杂交效率增加； （4）双链探针，浓度控制在0.1-0.5μg,浓度过高影响杂交效率。;2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20-25℃。 （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值。 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃。 ;3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交效率增加。 （2）高浓度的盐离子使碱基互补的杂交体更稳定；当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度。 ;4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度。低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35-42 ℃杂交。 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交。 ;5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度； （2）Cot?（复性率达0.5时的Cot：Co为单链DNA的起始浓度,t是以秒为单位的时间）值与反应体系中核酸复杂性成正比； （3）两个DNA样品浓度相同时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性。 ;6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少对探针的非特异性吸附； （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉。 ;第二节 探针的标记;;(二) 标记物种类 ;三、标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中。 ;;酶促标记法 （一）切口平移法（nick translation);（二）随机引物法;随机引物法所具有的优点： 1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记； 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题； 3、标记活性高，标记活性可达108cpm/μgDNA以上； 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记。;（三）PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反 应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中。;四、探针的纯化 1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质。 2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50。 3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针