植物遗传转化方法和技术.ppt

第四章 植物基因工程 天津大学 杨少辉 第一节 植物遗传转化方法 常用的植物转基因方法： 到目前为止, 已确立了11种植物转基因方法。根据其转化原理，可分为三大类，即利用载体的转化系统，不用任何载体，采用物理、化学方法直接将外源基因导入受体细胞的直接转化系统以及利用植物生殖细胞等种质媒介的种质转化系统。 现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和受体细胞等归纳如图4-1。 一、根癌农杆菌介导法 根癌农杆菌介导法的分子机制 农杆菌介导法需要具备的条件 农杆菌介导法的基本流程 （一）根癌农杆菌介导法的分子机制 1、植物冠瘿瘤——植物的一种癌症 （1）冠瘿瘤的起因： 由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。 （2）冠瘿瘤的侵染过程： 细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。 2、Ti质粒 根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的DNA分子。 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成激素的能力； 诱发植物产生冠瘿瘤； 赋予寄主分解冠瘿碱的能力； 决定寄主范围。 Vir区是一段长度为35KB操纵子； 包含六个基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。 T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻， 合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。 ③ Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。 ④ Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。 4、植物遗传转化的载体系统 野生型Ti质粒不能直接作为植物基因工程载体： 5、农杆菌介导的转化质粒的构建 （二）农杆菌介导法需要具备的条件 高效的植物基因转化受体系统 受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。 具有有效的选择系统。 稳定的转化技术和基因表达。 1、高效的植物基因转化的受体系统 成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。 受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径或其它非组织培养途径（如发苗产生子叶、胚轴等），能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。 A. 植物基因转化受体系统的条件 （1）高效稳定的再生能力 （2）较高的遗传稳定性 （3）具有稳定的外植体来源 （4）对选择性抗生素敏感 （5）对农杆菌侵染有敏感性 （6）具有经济价值或理论研究意义。 B. 植物基因转化受体系统的类型 2、选择系统 选择是为了将转化细胞与非转化细胞区分开，使转化细胞具有生长优势。在构建载体时，往往在目的基因上连上一个选择标记基因。 主要是编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。 最常用的有：新霉素磷酸转移酶基因( NPTⅡ)、新霉素抗性基因（neo）、庆大霉素抗性基因（gent）、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）,以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等。 新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418。 对茄科植物（烟草、马铃薯、番茄）转化特别有效，对豆科和单子叶植物效果不佳。 B、庆大霉素抗性基因（gent） 该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因，它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。 该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟草和番茄。 潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。 D、膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar） 该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对应的选择试剂为膦丝菌素（basta），膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。 （三）农杆菌介导法的基本流程 大豆子叶节法为例： 大豆子叶节器官发生系统的优化 大豆农杆菌转化系统的优化 大豆子叶节器官发生系统的优化 大豆无菌苗的获得 外植体的制备（类型、生理状态） 高分化率基因型的选择 丛生芽诱导培养基的确定 丛生芽伸长培养基的确定 生根培养基的确定 移栽 农杆菌转化系统的优化 选择压的确定 农杆菌侵染液的制备 外植体苗龄 预培养（时间） 农杆菌的侵染（浓度、时间） 共培养（时间） 选择培养 抗性芽的伸长 生根培养 二、基因枪法（微弹轰击法） 1、工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒