第7章外源化学物致突变作用20151021.ppt

* PCE呈灰蓝色，成熟RBC呈粉红色，NC呈蓝紫色。 PCE中含有的微核大小为细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计数1000个PCE中含微核的PCE数。 * 试验步骤 3. 染色体畸变分析 染色体畸变分析(chromosome aberration analysis)：观察染色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验(cytogenetic assay)。染色体畸变只能在细胞分裂中期相进行观察和分析。可观察到裂隙、断裂、断片、染色体环、双或多着丝粒染色体和染色体粉碎。 缺点：分裂中期相分析耗时且需熟练技巧。 * * 试验步骤 染毒：健康成年ICR小鼠，实验前24小时予环磷酰胺40 mg/kg腹腔注射。 收获细胞：处死动物前2~4h，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸NS约5 ml插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，1500 r/min离心10min，弃上清。 低渗：打散沉淀物，加入预温37℃的 0.075 mol/L KCl约6ml，混匀，37℃低渗15~20min，再加固定液 l~2 ml混匀，立即以1000r/min离心10min，弃上清。 * 固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温10~20 min，然后1000 r/min离心10 min，去上清液。同样方法再固定一次，弃上清液，留约0.5 ml。 制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的载波片10~15Cm高处滴片，干燥，用10％Giemesa染色液染色10~20min，轻微冲洗，自然晾干。 阅片计数。 * 试验步骤 染色体数目改变包括： 整倍体变异：原先2n的染色体变为多倍体如3n或4n等。 非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。 染色体结构改变包括：裂隙(G)、断裂(B)、碎片(F)、环形(r)、交换(E)以及复合性断裂等。 小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体数为40条，大鼠的染色体数为42条。 读片时每张标本片至少要分析100个中期分裂细胞。 * * 4. 姐妹染色单体交换试验 姐妹染色单体：从DNA合成期染色体复制至有丝分裂后期中心粒分裂这段时间，由同一个中心粒连在一起的二条子染色体称为姐妹染色单体。 姐妹染色单体交换(sister-chromatid exchange，SCE)：二条姐妹染色单体之间的物质交换就称为姐妹染色单体交换。即染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换。如单体内DNA链受损，则可能通过这种交换方式进行重组修复。 因此SCE的出现常表明DNA曾经受损。 * 将 5-BrdU加入合成DNA的原料中，经过两个分裂周期后，两条染色单体的其中一条双股DNA链内胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一条只有一股被取代。 染色和光处理后，两条染色单体的着色深浅不同。如果两条染色单体间发生等位交换，可根据每条染色单体内出现深浅不同的染色片段，在光镜下进行识别，清晰分辨出交换的染色单体，计数SCE数，判断受试物对DNA是否有损伤作用。 姐妹染色单体交换试验原理 * * * 5. 程序外DNA合成试验 正常细胞需经过细胞周期达到增殖的目的，细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，在S期的DNA合成是按固定程序进行的，称为程序性DNA合成(scheduled DNA synthesis)。 当DNA损伤时，会发生在S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成，称之为程序外DNA合成(unscheduled DNA synthesis, UDS)。它是机体为保证遗传稳定性而对DNA双链上出现的变异或损伤进行修复合成的过程。 * 程序外DNA合成试验原理 程序外DNA合成试验是观察分离或培养的细胞，加入标记DNA合成原料，如3H-胸苷，在S期外是否有DNA合成发生，即是以3H-胸苷掺入细胞量的增加，判断受试物是否造成DNA损伤。 * 6. 单细胞凝胶电泳(SCGE)试验 单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)试验：在单细胞水平定量检测有核细胞DNA损伤与修复的方法。 原理：DNA损伤时，断裂DNA片段在电泳时泳动速度比大片段DNA快，出现彗星状，即可判断DNA损伤。故又称为彗星试验（comet test)。 优点：此方法检测低水平DNA损伤的敏感性高，对样品的细胞数要求少，适应性高，操作简便，省时省力。 缺点：有待于标准化，尚未被国际组织接受。 * * 7. 观察方法的新进展 微核自动化检测技术：采用流式细胞仪和图像分析系统，采用RNA和DNA特异性染料，检