HLA-B27检测课件.pptVIP

HLA分型技术 HLA分型概述 方法比较 血清学分型 细胞学分型 基因分型 PCR-RFLP PCR-SSCP PCR-SSO PCR-SSP 应用 移植配型 疾病相关性研究 法医学 PCR-SSP检测HLA-B27 一、实验目的 掌握HLA基因分型的原理，学习PCR-SSP基因分型方法。 二、实验原理 编码HLA的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相应的序列特异性引物（ sequence specific primers ，SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。 HLA-B27检测操作流程 一、DNA的提取 1、取1ml RBC裂解液入血样管中混匀，裂解RBC; 2、离心4000rpm×1min; 3、重复步骤1-2两次，最后用棉签吸干管壁液体； 4、取40ul白细胞裂解液（SDS, Proteinase K)入上述 WBC管中混匀； 5、将WBC管于60oC水浴消化20min； 6、取出WBC管再于100oC，3-5min，灭活蛋白酶K； 7、离心10000rpm×2min。上清即为富含DNA的PCR模板。 二、PCR扩增 1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中（注意不要加到石蜡油层）； 2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min） * * 雷 萍 Variation 1% at a single genetic locus in a population of individuals Each polymorphic variant is called an allele In the human population, over 1,695 MHC alleles have been identified a b a b a b 3 559 23 126 34 81 DR DP DQ Class II 851 506 276 A B C No of polymorphisms Class I Data from http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla July 2007 Polymorphism in the MHC Polymorphic residues are located in the antigen-binding groove — Variation in amino acid sequences changes the shape of the groove Every HLA allele has its own unique sequences Specific sequence primer (SSP) is designed to bind to the allelic sequences complementarily Sequence specific primer is used to type HLA allele with PCR Sequence specific primer is used to type HLA allele with PCR 实验步骤 PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳 抽提DNA 三、实验材料和方法 1、血样：0.2 ml EDTA 抗凝血 2、红细胞裂解液 3、白细胞裂解液 4、PCR 混合液 PCR buffer HLA-B27 SSP Taq dNTP internal positive reference primers × 12 × 23 预变性：94 oC 2min 变性：94 oC 20sec 复性：67 oC 30sec 延伸：72 oC 30sec 变性：94 oC 20sec 复性：60 oC 30sec 延伸：72 oC 30sec HLA-B27扩增程序 三、电泳检测 吸PCR产物10ul加到2%琼脂糖凝胶孔内； 将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳160V×20min后取