病理学申报.doc

病原物的分离培养和纯化 姓名 朱云青 学号班级 农学院 植保（药）1班 摘要 培养基是人工配制的各种营养物质供微生物生长繁殖的基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加上实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，但不论是何种培养基，均应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐等。不同微生物对pH值要求不一样，所以配制培养基时，还应根据不同微生物对pH值的要求，将培养基调到合适的pH值范围。 关键词 PDA培养基 消毒 分离培养 材料、仪器与用具 1.1实验材料 柑橘炭疽病或辣椒炭疽病病害部位、PDA培养基（自制） 1.2仪器用具 超净工作台、培养箱、培养皿、试管、接种铲、接种针、70%酒精、0.1升汞、电炉等 2 实验方法步骤 2.1培养基的配制 PDA培养基的配制 其配方如下：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然。 (1)称量和熬煮 药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000ml。 (2)加热溶解 把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。 (3)分装 按实训要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜；半固体培养基以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直待凝。 (4) 加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。 (5)包扎 加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。 2.2 灭菌消毒 高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它是利用高压提高蒸汽温度，达到灭菌的目的，其操作步骤如下： (1)关好清水阀门，放入清水至标准度为止注意水量要加足，否则易造成事故。 (2)将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上气盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度，不要太紧，再旋紧相对的两个旋钮，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气不能彻底灭菌。 (3)通电加温，同时打开排气活门牌尽锅内的空气，当活门喷出的全是蒸汽的时候即可关闭阀门，一定要排尽空气以达到彻底灭菌的目的，通常压力表上升至5磅时打开放气降至零点再关闭。 (4)压力表的指针上升时温度也随之升高，当压力表升至15磅时蒸汽压相当于一个大气压，此时计算灭菌时间，控制热源，使处于15磅压力保持30分钟，就能达到完全灭菌目的，然后停止加温。 (5)一般应待压力表降至5磅时稍微打开排气活门，使锅内蒸汽缓慢排除，然后加大活门开口，勿使排气过快。 (6)当压力表降至0时锅内蒸汽完全排尽时，打开锅盖取出培养基。 2.3 分离培养 培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。（为防止细菌污染，倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴）。 (1)病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下。 (2)取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟，或用1%漂白粉消毒均可。 (3)消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。 (4)用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组织均应为病健相间组织。用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。每皿4——5块，排放均匀。 (5)用蜡笔在培养皿上注明分离代号，日期、姓名，将培养皿翻转放置于23—25℃ (6)3-4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。 3 实验现象 3.1实验结果 分离培养所得病原物菌落多数在平板培养基中生长良好，呈纯白色或灰白色，约有极少数被细菌污染，呈乳胶状，灰色。约3天后接种到斜面培养基中，生长数天后观察生长良好，无杂菌污染，呈黑褐色。 挑取菌落部分与显微镜下观察，其分生孢子着生于分生孢子盘内壁上，分生孢