广西大学高级生物化学课件—重组dna技术2.pptVIP

* * * * * * 将携带外源基因的RB-LB片段随机整合至植物染色体上 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 重组体构建 一、粘性末端连接 1、同一限制酶切割位点连接，碱基配对结合成重组分子。 2、不同限制酶切割位点连接，因有相同末端，经配伍后连接 DNA片段A DNA片段B 5′···G G A T C C···3′ 5′···A G A T C T···3′ 3′···C C T A G G···5′ 3′···T C T A G A···5′ 不同的限制性内切酶水解 混合后经DNA连接酶连接 BamHI BglII ···G G A T C T··· ···C C T A G A··· ···G G A T C T··· ···C C T A G A··· 粘端 配伍末端连接 重组体构建 Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to be joined. The optimal substrate for terminal transferase is the 3 OH at the end of a single strand of DNA at least three nucleotides long. 粘端的生成 重组体构建 二、平端连接 平端在T4连接酶作用下可以连接。 三、同聚物加尾连接 利用同聚物序列，如聚A与聚T之间经退火作用完成连接，需末端转移酶。 四、人工接头连接 用人工和成某酶切割序列的接头，与DNA平端相连后形成粘性末端再连接。 重组体构建 重组体构建 两个技术：制备感受态细胞和导入方法(化学转化和电转化)。 感受态细胞制备 经某些方法处理后，具备接受外界DNA 能力的细胞，称为感受态细胞。 目前常用的多为E. coli K12株的衍生物。 DH5α, JM109 (RecA1, endA1, gyrA96, thi, supE44, relA1, △(lac-proAB)/F’ [traD36, lacIq, lacZ △M15]) 限制酶缺陷型使导入DNA免遭降解 。 重组缺陷型，以保证导入DNA完成独立存在 ，不与细菌中基因组DNA重组。 重组体导入细胞 针对载体携有某些标志基因或目的基因的筛选方法，直接测定基因及表型。 1、抗药性标志选择 含抗药性基因的载体（Amp?Tet?Kam）转入的细菌，可在含该药物的培养板上形成菌斑，进行初步筛选。 2、标志补救 导入基因的表达产物与受体菌的营养缺陷互补，利用营养突变株筛选叫标志补救。 重组子的筛选 一、直接筛选法 【实例】M13载体含?-半乳糖苷酶N端序列，而突变株细菌中可表达?-半乳糖苷酶C端序列，只有在两者共同表达时，才有酶的活性。 x-gal ?-半乳糖苷酶 兰色 x-gal 缺少?-半乳糖苷酶 白色 重组子的筛选 3、分子杂交法：用32p标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的重组DNA片段进行杂交，直接鉴定目的基因。 用特异的抗体与目的基因的表达产物相互作用进行筛选。 二、免疫学方法 重组子的筛选 重组子的筛选 蓝白斑筛选 重组子的筛选 Identifying a clone with the desired DNA segment 氨基酸序列 预测核苷酸序列 分子杂交 【实例】脆性x综合征（fragile x syndrome）：一种精神痴呆，研究发现细胞内有些DNA含脆性位点，并鉴定出含脆性位点DNA序列的特殊标志，但致病的分子机制不清楚，1991年用YAC克隆及分子杂交技术证明脆性位点是一个（CGG）n重复序列。正常人含6-54，病人高达数百个（?200）。重复序列的增多使所在基因FMR-1不能转录出正确的mRNA，受累者出现综合征。 基因工程的应用 一、疾病基因的发现 基因工程的应用 定点突变 基因工程产品 A tobacco plant in which the gene for firefly luciferase i