生化前沿蛋白质功能研究方法的一点探讨.pptVIP

蛋白质功能研究方法的一点探讨 蛋白质功能研究起始—生物信息学分析 背景：信号蛋白，调节蛋白以及大多数其他的蛋白质都具有包括相互作用区域在内的好几个结构域； 应用：综合利用生物学，计算机科学和信息技术而揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘。 蛋白质功能研究起始 序列同源性分析为抗体制备（抗原序列选择）、siRNA,shRNA等的设计提供预测 蛋白质功能研究起始之试验 蛋白质相互作用研究 事物是普遍联系的。世界上的一切事物都处在普遍联系之中，没有任何一个事物是孤立地存在的，整个世界是一个相互联系的整体。 We‘re all connected: to each other biologically, to the Earth chemically, to the rest of the universe atomically.” （Feynman） 蛋白质相互作用的生理功能 Localization 蛋白质的亚细胞定位 蛋白质相互作用的生理功能 *蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。 *错误的相互作用可能导致病理现象的出现。 动态的蛋白质相互作用与翻译后修饰 Dynamic behavior of cells in response to changing conditions is highly dependent on posttranslational modifications; 细胞面对不断改变的环境表现出来的动态行为有赖于蛋白质的翻译后修饰以及它带来的蛋白质相互作用的变化。 蛋白质相互作用的研究方法与技术 GST-Pull down 免疫沉淀 Immunoprecipitation 质量作用定律决定IP的成功度 免疫沉淀（非变性） Co-Immunoprecipitation /共免疫沉淀 免疫沉淀（非变性） Co-IP特点 Advantages of co-immunoprecipitation- Proteins in their native state- At their native concentration (unless transfection) Disadvantages of co-immunoprecipitation- Mixing of compartments during cell lysis, i.e. interacting proteins might not be in the same cellular compartment- Detection of stable interactions only- Does not indicate whether interaction is direct- Antibodies required 非变性免疫沉淀 免疫沉淀（非变性） 免疫共沉淀： 基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑 研究方案:Affinity purification MS 免疫沉淀产物的质谱鉴定结果中通常包含很多非特异的蛋白质信息 核糖体蛋白 代谢酶类 热休克蛋白 泛肽酶 高丰度的细胞骨架蛋白 血清蛋白（如果使用是IP亲和的方式） After Co-IP and MS identification 利用亚细胞定位及蛋白质相互作用等信息进行蛋白质功能归属 寡沉淀( oligoprecipitation) 大多数蛋白质经过磷酸化等修饰后才能被激 活,发挥其特定的功能，而在蛋白质活性状态 和非活性状态时，与其发生相互作用的物质 有所不同。 传统的免疫共沉淀方法不能区分哪些蛋白是 与靶蛋白活性状态时相结合的。 QUICK基本原理 利用轻、重稳定同位素标记培养基中氨基酸，分别 供给2 组靶蛋白表达细胞代谢生长； 采用RNA 干扰技术降低其中1组细胞的靶蛋白表达量； 利用免疫共沉淀方法分别从2组细胞中获得与靶蛋 白相互作用的蛋白质复合体； 混合2 组复合体,进行定量质谱分析； 由于其中1组细胞靶蛋白量的减少,导致与其真实相 互作用形成的复合体量也相应降低,在质谱图上应表 现为非等量的相邻峰,而等量的相邻峰则代表了分离 纯化时与抗体或基质结合的非特异相互作用蛋白质。 蛋白质功能研究的策略 * 当 X-Y 的复合物是瞬间形成的或解离常数大时， 可以考虑使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker) X NH2 Y NH2 活性基团 活性基团 A ° 细胞可渗透交联剂在Co-IP中的应用 带Tag的目标蛋白与固相基质偶联 目标蛋白带上Tag 目标蛋白相互作用蛋白的亲和纯化 目标蛋白复合物的SDS分离 蛋白质条带的切割和酶解 质谱与生物信息学分析 文献与其他数据库的功能分析 实验验证与功能