脉冲场凝胶电泳技术对一起肠炎沙门菌疫情分子生物学分析.docVIP

脉冲场凝胶电泳技术对一起肠炎沙门菌疫情分子生物学分析 用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对一起肠炎沙门菌暴发疫情进行病原菌分子特征、菌株之间的遗传相关性分析。方法 对分离到的菌株进行PFGE分析，对菌株进行分子分型，以BioNumerics V4.0软件UPGMA方法进行聚类分析。结果 食物中毒分离4株肠炎沙门菌以Xba I酶切后PFGE可分为同一型别。结论 该次食物中毒的暴发为同一型肠炎沙门菌引起，可能有共同的传染来源。 肠炎沙门菌是一种革兰阴性杆菌，常寄生于人和动物肠道或肠系膜淋巴组织中[1]。肠炎沙门菌引起的食源性疾病引起了国内外高度重视，世界卫生组织为此建立WHO GSS监测网[2]。达州市2008-07-28发生一起肠炎沙门菌引起的食物中毒，为查找传染来源、分析传播链，加强监控和阻断，以达到预防和控制疾病的目的，运用脉冲场凝胶电泳(PFGE) [3]等方法对这次肠炎沙门菌暴发疫情中分离的菌株进行分子生物学研究[4]，现将结果报告如下。 1 材料与方法 1．1菌株来源 4株菌（SCGS08072-SCGS08075）为达州市2008-07-28一起食物中毒暴发疫情中剩余食品和患者肛拭子中分离所得。VITEK32全自动微生物分析系统和血清凝集鉴定4株菌均为肠炎沙门菌。PFGE分析用分子量标准参考菌株一沙门菌H9812，为全国病原细菌实验室监测网络PulseNet China的标准菌株[5]。 1．2 试剂和仪器 试剂琼脂糖SeaKem Gold Agarose(Cam—braex Bio Science Rockland)、限制性内切酶Xba I(Promega公司)、蛋白酶K(MERCK公司产品)等试剂用于脉冲场凝胶电泳。引物合成于上海生工生物有限公司。仪器脉冲场凝胶电泳仪为CHEF—DR nlsystem(Bio—Rad USA)，凝胶成像系统为Gel Doc XR(Bio—Rad USA)，浊度仪为VitekColor／meter(BioMer／eux France)。 1．3 实验方法 1．3.1 PFGE实验 取新鲜琼脂培养物集菌均匀悬浊于lml细胞悬液[5] [100 mM Tris—HCL(pH值8．0)，100 mM EDTA(pH值8．0)]中，调节浓度，使其019值为4．0～4．2。取400ul菌悬液37℃孵育5min，分别加入蛋白酶K 20ul(储存液浓度为20 mg／m1)至终浓度0．5 mg／ml，再与等体积1％ Seakem Gold琼脂混合，加入模具[6]。在室温下凝固后取出胶块加5ml细胞裂解液[50 mM Tris(pH值8．0)，50 mM ED—TA(pH值8．O)，加l％十二烷基肌氨酸钠]和25ul蛋白酶K(终浓度O．1 mg／m1)，混匀，54℃水浴轻摇2 h，转速约170 rmp [7]。预热TE 50℃水浴15 min洗胶块4次。切2 mm胶块加入195ul酶切缓冲液中，再加入5ul Xba I，37℃酶切2 h。酶切好的胶块粘在梳子上制胶、电泳，电泳时泵设为70，电泳温度14℃ ，电压梯度6 V／cm，脉冲时间2．16 S～54．17 S，电场夹角120[8]。电泳时间19 h。0．1 g／nd EB染色30 min，纯水中脱色30 rain，凝胶成像仪上读取图像 。 1．3.2 聚类分析 使用BioNumerics(Version 4．0)数据库软件(Apphed Maths BVBA，Behum)进行聚类分析，方法采UPGMA(Unweighted Pair group Meth—od using Arithmetic averages)，聚类相似性系数(距离)采用的是基于条带比较的Dice。Dice=2×N(N+M)，式中N表示能匹配的条带的个数，M表示所有条带的个数(2个菌带型上的条带个数总和，再减去匹配的条带个数) [9]。根据聚类结果，按不同菌株的相似性系数进行分型，小于90％的定为不同的型，大于90％而小于100％的为不同的亚型，相似系数等于100％的不同菌株为同一亚型 [10]。 2 结果 2．1 PFGE分型结果 4株菌经Xba I酶切，脉冲场凝胶电泳后，分出清晰的条带，其PFGE图谱见(图1)中SCGS08072-SCGS08075。 2．2 聚类结果 根据BioNumerics对对4株菌进行了相似性比较。结果此起疫情的分离菌株是同一种型别的。聚类图谱分析相似性=100％(见图1)，可以认定为同一菌株引起的食物中毒。 3讨论 为了预防和控制暴发疫情、查找传染来源和分析传播链，需要一种灵敏度高、分型力和重复性都很好的分型方法来追踪监测暴发、流行。PFGE通过分型可以鉴定比较菌株是否一致。对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调