荧光定量PCR的历史.docVIP

荧光定量PCR的历史：荧光定量PCR是PCR的一种。PCR仪目的为了基因扩增。在基因扩增中最重要的就是升降温过程，最早的PCR就是三个水浴锅,一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。PCR的结果需要借助其他手段来检测。后来随着定量技术的发展，将PCR和检测做成一体，就形成了定量PCR仪。由于应用的是荧光技术，同时在每个扩增过程都能实施监控，所以标准的叫法为实时荧光定量PCR仪。准确的讲实时荧光定量PCR没有自动加样和标本处理系统，只能算半自动的。PCR仪简单的讲，就是一个温控设备和一个检测设备。荧光实时定量PCR技术最早是在1992年由一位日本人Higuchi第一次报告提出的，他当时想实时地看到PCR反应的整个过程，由于当时EB（溴化乙锭）的广泛使用，最直接想到的标记染料就是EB，可以插入到双链核酸中受激发光，在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，考虑到PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。这样，在普通PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装置，第一台实时定量PCR仪就诞生了。而真正市场化的美国应用生物系统公司自1996年推出荧光定量PCR仪，ABI公司一直标称其推出了全世界首台荧光定量PCR仪目前市面上有多家品牌，主要有ABI、Roche、Bio-Rad和MJ荧光定量PCR的技术定量PCR技术自产生以来，不断发展完善，到目前为止已经非常成熟了。标记方法由最初单一的染料法，发展到了特异性更高的探针法，如Taqman、Molecular Beacon、Fret等不同方法的标记探针，其中由于Taqman探针的广泛使用，实时定量PCR的方法也称为Tagman法。在过去很长一段时间里，由于PCR检测的灵敏性和不稳定性，容易产生假阳性，国家对这种检测方法在临床上的应用是禁止的。但是随着荧光定量PCR技术的发展成熟和完善，特别是Taqman方法的广泛使用，使得荧光定量PCR以一种新的PCR检测技术得以在在临床检测上使用，如对病毒、病菌及其它致病微生物，致病基因的检测。 Taqman探针法具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好；由引物、探针序列和引物探针相互作用关系的双重保证克服了普通PCR的缺陷，现在国家对这方面的限制正逐步解开，目前正在规范相应的法律法规，为荧光定量PCR技术在分子诊断中的广泛使用做准备工作。最常用的有三种检测模式：１、R Green I检测模式。2、Taqman探针法3、杂交探针荧光定量检测技术的优势相对于抗原抗体法检测具有以下优势：1. 研发方便，设计探针和摸定反应条件可以在短时间内完成，顺利的话，只需几次反应和几天的工作量就可以完成一种检测方法的建立。而拿到一个好的抗体至少需要一个完整的免疫周期，还不考虑筛选获得一个高特异性、高滴度免疫株的成功几率。 2. 检测灵敏度高，是一个基于PCR的信号放大检测系统。 3. 可以准确定量。 荧光定量PCR的应用荧光定量检测技术在临床诊断方面很多，主要集中在各种病原体引起疾病的临床诊断，如肝炎类疾病、性病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等。荧光定量PCR的应用不仅限于临床检测，在基础研究和海关、食品卫生检疫方面的应用前景都相当广泛。基础研究中，对某一样品中目标基因含量的测定需求是相当广泛的，荧光定量PCR技术具有操作方便、反应快速的特点，可以对一些微量样品进行检测。所以在新药开发、超早期感染用药物及疗法的研究与开发、药物疗法研究、新诊断及检验试剂的开发、血液检验漏检率等方面，荧光定量PC技术有着广泛的应用前景。在海关卫生检疫方面，进口的粮食、食品、花果是否安全，是否含有危险或潜在危险的成分，都可以用荧光定量PCR技术进行检测。一些瘟疫流行地区进口的相关食品也需要进行检测，比如前一段时间，欧洲流行疯牛病，日本流行猪口蹄疫，那么从这些地区进口相应的肉品及肉类加工产品，就要进行食品卫生检疫在食品卫生检疫方面，如转基因食品，由于其是否安全目前尚无定论，因此有些国家明确规定转基因食品需要标签标识区分，我国也正在出台类似的法律法规。此外一些生物类的恐怖袭击等，都可以用荧光定量PCR的方法进行快速检测。所以荧光定量PCR最明显的对象主要是医院的检验科、中心实验室、临检中心、地方的疾病控制中心、生物技术公司、血液制品相关的部门。当然科研院所、学校是少不了的。市场竞争情况：现在国内国外荧光定量PCR仪的品牌不是很多，国内外品牌及产品代理商一览（见表一）ABI美国应用生物公司：老牌的生物公司贵族，荧光定量PCR仪有四种型号的。其中5700、7700已停产；现在剩Prismreg; 7000荧光定量PCR仪、Pris