浅谈对实时荧光定量PCR技术的理解.docxVIP

PAGE \* MERGEFORMAT8 浅谈对实时荧光定量PCR技术的理解 实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)是一种实时监控DNA扩增反应的技术。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累进行实时监测整个PCR过程，并将DNA的累积速率绘制成动态变化图，在扩增的指数期对起始模板进行定量，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。该项技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，促使PCR技术从定性到定量的飞跃，而且集特异性强、自动化程度高、灵敏度好、污染少等优点为一体，现已在生物研究、医药、食品等领域得到广泛应用。 RT-qPCR的基本原理和应用 基本原理 RT-qPCR 的分类方法根据其化学原理可分为探针类和非探针类两种, 下面以TaqMan探针类和SYBR GreenⅠ非探针类两种常见方法简述其原理。 TaqMan探针法 TaqMan探针是一种长度为20-24bp寡核苷酸探针，在其5′末端标记一个荧光报告基团(reporter,R)， 在3′末端则标记一个荧光淬灭基团。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入TaqMan荧光探针,其结合位点在两条引物之间,只与模板特异地结合。当完整的探针与目标序列杂交时,荧光基团发射的荧光信号与3′端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时,聚合酶的5′外切酶活性将探针进行酶切,将DNA探针逐个降解，使得荧光基团与淬灭剂分离。这样 PCR体系中荧光的强度与 PCR 产物量之间呈正比,可通过测定荧光强度而对 PCR 产物定量。如下图1-1至图1-11所示为TaqMan探针工作原理简图：  荧光共振能量转移，FRET 能量 激发光 淬灭基团 激发光 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 1切断的探针，检测到报告荧光 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 2完整的探针，检测不到报告荧光 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 3变性 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 4退火 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 5延伸（1） 具有5′-3′外切酶活性 5′-3′外切酶活性 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 6延伸（2） 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 7延伸（3） 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 8延伸（4） 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 9延伸（5） 报告基团和淬灭基团分离而发光 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 10延伸（6） 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 11延伸（7） SYBR GreenⅠ染料法 SYBR GreenⅠ荧光染料是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于DNA双链的小沟区域，其最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。因此，根据荧光信号检测出PCR体系中存在的双链DNA数量。如图1-12和图1-13为SYBR GreenⅠ工作原理简图: 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 12 SYBR染料处于游离状态 图  STYLEREF 1 \s 1 SEQ 图 \* ARABIC \s 1 13 SYBR染料与双链DNA分子结合 两种方法的优缺点 总而言之，探针类是利用与靶序列特异性结合的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但价格昂贵。后者可以与所有的双链DNA相结合,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低，更简便易行。 特别地，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。可以通过测量升高温度后荧光的变化帮助降低非特异产物的影响，由解链曲线来分析产物的均一性有助于