临床检验仪器与技术试验指导(电泳+PCR).docxVIP

实验一PCR基因扩增一、实验目的与要求（1）掌握PCR反应的基本原理；（2）了解PCR的基本操作流程。二、实验原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。1. 缓冲液：10～50 mMTris- HCl (pH8.4)：维持Taq酶作用环境的偏碱性。25～50 mMKCl：促进引物退火，50 mM会抑制Taq酶的活性。100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)：对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。2. dNTPs :dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物，dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系。0.02～0.2 mM，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。dNTPs可与Mg2+结合，应注意Mg2+浓度与dNTPs浓度之间的关系， Mg2+浓度比 dNTPs 浓度高0.2～2.5 mM。过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。保存：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。3. MgCl2：1.5～2.0 mMTaq酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜过量：增加非特异扩增并影响产率，过低：则酶活性显著下降。4. 引物 (Primer-P)：0.2～1μM预扩增核酸片段两端的已知序列，是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。5. Taq DNA聚合酶：耐高热0.5～5 U / 100 μl特点：以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将４种脱氧核苷酸以碱基配对方式，按引物5‘-3’的方向，合成新的DNA链；无Klenow酶所具有的3‘-5’外切酶活性，故无校正功能，错误频率为0.25％，即在25轮循环后，其扩增产物的顺序中400个碱基可能出现一个篡改（错误掺入）碱基。偏高：引物非特异产物的扩增偏低：产物量降低6. 模板DNA (Template):最低102～105bp DNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。1～5μl过高：非特异产物增加过低：产量降低传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。7. 水：去离子水，补足整个反应体积。按顺序将各成分加入一无菌PCR专用离心管，混匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。三、仪器及试剂1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、PCR薄壁管、电泳