第九章 核酸的体外扩增.ppt

第十一章 核酸的体外扩增聚合酶链式反应连接酶链反应RNA的体外扩增 第一节 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项突破。此技术能够特异地扩增任何所希望的目的基因或DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古等方面有重要的应用价值，并对分子生物学技术的发展给予巨大的推动。 flash PCR flash 二、PCR引物的设计 引物的设计一般遵循下列原则： １.上游引物与目的DNA５’端序列完全相同；  下游引物与目的DNA３’端序列互补 ２.引物长度以15-30个碱基为益； G+C含量为45-55％ ３.引物内、引物间不应有互补序列 ４. 碱基分布随机 ５.引物与非特异扩增区的同源性不超过70% 6. 3′端必须互补， 5′端可游离 三、模板的制备 DNA 1.从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 RNA 新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理 四、PCR的基本反应 （一）、以DNA为模板的反应： 10×缓冲液 　 10 ?l 4种dNTP混合物 　 各200 ?mol/L引物 　　　　 　 各10～100 pmol　模板DNA 　　　 　0.1～2 ?g　Taq DNA聚合酶 　 2.5 u　Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L加双蒸水至 　 100 ?l  PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能 （二）以mRNA为模板的反应 mRNA 5 ?l 5× Buffer 4 ?l dNTP 2 ?l(10mmol/L) RNasin 1 ?l(20u) 逆转录酶 1 ?l(10u) Oligo(dT)12-18(或下游引物) 1 ?l ddH2O 6?l /20 ?l 42℃水浴1小时，95 ℃水浴10分钟灭活逆转录酶。向上述反应体系中添加如下试剂： 10× Buffer 5 ?l 25mmol/L Mg2+ 3?l Taq酶 0.5 ?l（2.5u） 上游引物 1?l ddH2O 20.5?l /50 ?l 按PCR循环参数进行 RT--PCR  （三）PCR产物的积累规律 DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。 反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n），随着目的DNA的积累，在引物—模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和—平台期 。（30个循环） “平台效应”出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素。 （四）PCR反应的自动化 五、PCR反应条件的控制 （一）PCR反应的缓冲溶液 提供合适的酸碱度和某些离子 10～50mmol/L Tris-HCl缓冲液 50mmol/L KCl BSA或明胶 （二）镁离子浓度 TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+ ， Mg2+浓度过高导致非特异扩增。 一般常用1.5mmol/L （三）底物浓度 dNTP浓度在20～200 ?mol/L 四种dNTP必须浓度相等 （四） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活性 （五）引物 引物浓度一般为0.1～ 0.5?mol/L （六）反应温度和循环次数 变性温度和时间 95℃/ 30 ～60s 退火温度和时间 45～55℃/30 ～60s 延伸温度和时间 72℃ 1min 3min 循环次数 25～30 不超过35 六、PCR中应注意的事项 PCR反应中可能出现的问题： 假阴性，不出现扩增条带 假阳性 出现非特异扩增带 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及