莽草酸抑制BLM解旋酶活性与`肝癌细胞探讨.docVIP

莽草酸抑制BLM解旋酶活性及肝癌细胞的研究 　　[摘要] 目的 研究莽草酸（ shikimic acid）对BLM 解旋酶的生物学特性的影响及对肝癌细胞的抑制作用。方法 2012年11月―2013年7月应用荧光偏振技术研究莽草酸对 BLM 解旋酶的 DNA 结合活性，CCK-8检测莽草酸对肝癌细胞增殖的抑制作用。 结果 培养24 h，A100（100 μmol/L）、A50（50 μmol/L）、A25 （25 μmol/L）三组与不加药对照组相比，抑制率分别为25.73%、21.31%、18.25%，对肝癌细胞HepG2增殖具有抑制作用（P 　　1.4 莽草酸对肝癌细胞系HpG2生长抑制作用的研究 CCK-8检测莽草酸对肝癌细胞增殖的抑制作用 1.4.1 实验分组 正常对照组：10%FBS的高糖DMEM。乙醇对照组：10%FBS的高糖DMEM+无水乙醇（浓度小于0.01%）。实验组10%FBS的高糖DMEM+莽草酸（0.5，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100 μmol/L） 1.4.2 CCK-8检测莽草酸对肝癌细胞增殖的抑制作用 ①在24孔板里培养肝癌HpG2细胞，分别于一周内每天天消化细胞进行计数，得出细胞生长曲线。②取处于生长对数期的肝癌细胞，在96孔板中接种细胞悬液（8×103/孔），将96板放在培养箱中预培养（37℃，5% CO2）。③细胞贴壁后，对实验组和对照组进行饥饿培养3 h，后根据实验分组，加入莽草酸培养细胞，设无细胞组为空白对照组，每组设5个复空，分别于24，48和72 h后向每孔加入10 μL CCK溶液和90 uL的细胞培养基。④将培养板在培养箱内孵育1～4 h。⑤用酶标仪测定在450 nm处的吸光度 1.5 统计方法 全部资料采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。药物组与不加药物对照组BLM表达水平比较，采用两独立样本t检验，计数资料以%表示，采用χ2检验，以P0.05），说明莽草酸不能抑制 BLM 解旋酶的结合活性 图A、B.随着莽草酸浓度升高，单链DNA（A2）和双链DNA（A1A2）与莽草酸反应后荧光偏振值无明显变化，说明莽草酸不与单链DNA（A2）或者双链DNA（A1A2）结合，加入酶后荧光偏振值明显升高并且与药物浓度无关，说明先前加入的莽草酸不能抑制BLM解旋酶与单链DNA或者双链DNA（A1A2）的结合。图C、D.加入酶后荧光偏振值明显升高，说明酶与单链DNA（A2）或者双链DNA（A1A2）发生结合，加药物后随着药物浓度升高荧光偏振值无明显变化，说明加入的莽草酸对BLM解旋酶与单链DNA（A2）或者双链DNA（A1A2）的结合无抑制作用 2.2 莽草酸对肝癌细胞系HpG2生长抑制作用的研究 莽草酸对HpG2细胞的生长有一定的抑制作用。加药24 h后监测，A100（100 μmol/L）、A50（50 μmol/L）、A25 （25 μmol/L）3组与不加药对照组相比，抑制率分别为25.73%、21.31%、18.25%，对肝癌细胞HepG2增殖具有抑制作用（P0.05） 3 讨论 3.1 荧光偏振技术研究莽草酸对 BLM 解旋酶的 DNA 结合活性 荧光偏振技术被广泛应用于荧光免疫分析、食品安全与环境监测、药物筛选、测定蛋白质-核酸及蛋白质-蛋白质的相互作用[2]等领域。利用荧光偏振技术，许厚强等[3]发现甘草次酸对BLM解旋酶的活性有抑制作用。此实验研究发现莽草酸与单、双链DNA均不能发生结合反应，图1中A图显示莽草酸与单链DNA（A2）反应后使得荧光各向异性值未见升高，而B图显示莽草酸与双链DNA（A1A2）的反应后荧光各向异性值也未见升高，可知莽草酸与单链DNA和双链DNA均不能结合。加入BLM解旋酶后，发现荧光各向异性值明显增高，但是随着莽草酸浓度增加，经不同浓度莽草酸作用后的DNA链与BLM解旋酶发生反应后的荧光各向异性值无明显变化（P0.05），这就说明莽草酸不能抑制DNA链与BLM解旋酶结合。同时，我们采用在加入DNA链后，先加入BLM解旋酶再加入不同浓度莽草酸进行测试，图1中C、D图显示：加入BLM解旋酶后荧光各向异性值迅速升高，说明DNA链与BLM解旋酶发生了结合。再加入不同浓度莽草酸，反应后的荧光各向异性值与加入BLM解旋酶时荧光各向异性值相比无明显变化（P0.05）。说明莽草酸不能与DNA链与BLM解旋酶发生反应后的复合体结合 3.2 莽草酸对肝癌细胞系HpG2生长抑制作用的研究 在对CCK-8实验的结果分析中我们发现，在芒草酸浓度较低时（0.5 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L），其对HpG2细胞无抑制作用。加药24 h后监测，A100（100