层析简介幻灯片.pptxVIP

层析技术简介 一.液相层析的原理和参数 二.层析方法确定的步骤和优选 液相层析的原理和参数 层析的种类 分子排阻层析Gel Filtration 离子交换层析Ion Exchange(IEC) 疏水层析Hydrophobic Interaction 亲和层析Affinity 金属螯合层析(IMAC) 分子排阻层析Gel Filtration 分子排阻层析又可称为凝胶层析或分子筛层析，是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术。单个凝胶珠本身象个筛子。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 分子排阻层析Gel Filtration 离子交换层析Ion Exchange(IEC) 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。固定相是离子交换剂的层析分离技术。样品中待分离的溶质离子，与固定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱 离子交换层析Ion Exchange(IEC) 疏水层析Hydrophobic Interaction 固定相由非极性物质(如烃类、苯基等)组成的层析。非极性分子间或分子的非极性基团间具有吸引力，不同分子的非极性基团与固定相非极性物质结合的强弱不同，从而达到分离。多用于蛋白质分析和分离 亲和层析Affinity 利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法。如用寡脱氧胸苷酸-纤维素分离纯化信使核糖核酸；用DNA-纤维素分离依赖DNA的DNA聚合酶；用琼脂糖-抗体制剂分离抗原；用金属螯合柱分离带有成串组氨酸标签的重组蛋白质等。 亲和层析Affinity 金属螯合层析(IMAC) 金属螯合层析是利用固定相偶联的配基——亚氨基二乙酸(IDA)及金属离子发生螯合作用，该金属离子又与蛋白分子中的某些含有巯基或咪唑基的氨基酸结合。 金属螯合层析主要分为3个阶段：第一阶段是螯合介质与二价金属离子作用生成金属螯合介质；第二阶段是在一定的条件下金属螯合介质与被分离蛋白质分子形成金属螯合复合物；第三阶段是从金属螯合介质上将被分离物质解吸下来。  金属螯合层析(IMAC) 层析的一些参数 吸附等温线 塔板效率 动态载量 层析的参数1--吸附等温线 概念：吸附等温曲线是指在一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。在一定温度下,分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附方程式来表示 层析的参数1--吸附等温线 吸附等温线：线性和非线性 线性：浓度不高时，峰的位置不变，峰的面积与浓度成正比 非线性：浓度高时，峰的位置偏移，面积不成正比 层析的参数2--塔板理论 动力学分析：塔板理论 1.理论塔板数 2.柱效 3.塔板高度 N=5.54(V/W1/2)2 H=L/N W1/2：半高宽 V：洗脱体积 层析的参数2--塔板理论 柱效和流速的关系 1.有一个最佳流速  2.塔板越高，效率越低  3.一般选择平衡产量位置 层析的参数3--动态载量 动态载量：制备层析介质的重要性能指标，目标是追求更快条件下的更高动态载量。 概念：定流速下介质的可用效率 测定方法： 将柱移离系统 进样冲洗系统至检测讯号平头 连接层析柱 继续加样至检测讯号达平头数值的5% 将步骤3，4记下期间体积 将样品中蛋白浓度乘以此体积 层析的参数3--动态载量 影响因素一：介质孔径 孔的开放性越大，扩散越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反 传统介质随流速上升，载量下降迅速；现代介质随流速上升，载量下降不明显 绝对值上还是传统介质的载量最高，最大100mg/ml 影响因素二：蛋白大小 蛋白质越小，扩散速度越高，越接近平衡，动态载量对流速越不敏感。 层析的参数3--动态载量 影响因素三：介质颗粒 介质颗粒越小，载量越高 条件允许的情况下尽量使用小颗粒 影响因素四：吸附基团长度 吸附基团排布