16SrDNA实验原理.docVIP

实验原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S?rDNA序列分析等。? 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S?rRNA、16S?rRNA、23S?rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S?rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S?rDNA。5S?rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S?rRNA含有的核苷酸数几乎是16S?rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。而16S?rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S?rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。 16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S?rDNA鉴定细菌，其技术路线如下： ? ? DNA提取 ? PCR扩增 PCR实验原理 即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq PolymeraseDNA Marker，溶菌酶dNTP和E.coli JM109感受态细胞pMD18-T Vector、琼脂糖SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0） 三、操作方法 1. 细菌基因组总DNA的提取 接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。 (1)菌体收集：取1.5 mL新鲜的菌液于EP管中，12000 r/min离心30 s，弃净上清，收集菌体。 (2)辅助裂解：加100 μg/mL溶菌酶50 μL，37 处理。 (3)裂解：向每管加入200 mL预冷的SDS裂解缓冲液，用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。 (4)向每管加入66 μL 5 mol/L NaCl，充分混匀后，12000 r/min离心10 min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。 (5)将上清转移到新EP管中，加入等体积的Tris饱和酚，充分混匀，12000 r/min离心3 min，进一步沉淀蛋白质。 (6)取离心后的水层，加等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1），充分混匀后，12000 r/min离心3 min，去除苯酚。 (7)小心取上清，用预冷2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，13000 r/min离心15 min，弃上清。 (8)用400 μL75%的乙醇洗涤2次。 (9)室温干燥后，用40 μL 1×TE溶解DNA。 (10)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。 (11)提取的基因组总DNA-40冰箱保存备用。 PCR扩增细菌的16S rDNA (1)16S rDNA的PCR引物：采用细菌的通用引物(2)PCR反应体系为（20μL）： 灭菌蒸馏水 8.9 μL， 10×buffer 2 μL， 10 mmol/L dNTP 0.4 μL， 27F和1492R引物μL， DNA模板 0.5 μL， Taq polymerase 0.2 μL。 (3)PCR反应条件： 93 ℃预5 min、94变性、55 s、72延伸，循环30次，72延伸min。(4)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。PCR扩增目的片断的纯化 通过PCR扩增出大量的目的片段，经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切下含有目的条带的胶块装入1.5 mL的EP管中，用B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收DNA，操作按说明书进行，方法如下： (1)加入700 μL溶胶液，55水浴溶胶，其间偶尔摇动，直至胶块全部溶解。 (2)将溶胶液转移至吸附柱中，12000 r/min离心30 s，重复一次，提高回收率。 (3)向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12000 r/min离心30 s，倒掉废液，重复漂洗一